维生素C的测定

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第163页（4161字）

方法一：2，6－二氯酚靛酚滴定法测定维生素C含量

维生素C易溶于水，遇碱．热．重金属等易被氧化破坏。故常用稀酸溶液提取。

维生素C具强还原性，能使2，6－二氯酚靛酚还原，因此利用氧化型2，6－二氯酚靛酚滴定还原型维生素C量，在酸性溶液中其终点为微红色。

试剂

(1)2%盐酸溶液：取56．8毫升浓盐酸(分析纯，比重1．19)。定容至1000毫升。

(2)标准维生素C(0．5毫克／毫升)：准确称取纯维生素C50毫克，溶于2%盐酸中，定容于100毫升容量瓶中。

(3)2，6－二氯酚靛酚溶液：称碳酸氢钠52毫克，溶于200毫升沸水中，然后称取2，6－二氯酚靛酚50毫克，溶于上述碳酸氢钠溶液中，冷却后置冰箱中过夜，次日过滤置250毫升容量瓶中，用水稀释至刻度。混匀，贮于棕色瓶中，冰箱保存，每星期至少标定1次。

标定方法：2，6－二氯酚靛酚的标定，

①．取5毫升维生素C标准溶液加入2%HCl溶液5毫升，混匀，用2，6－二氯酚靛酚溶液滴定至溶液呈粉红色，15秒钟不褪色为终点。

②．计算：

每毫升2，6－二氯酚靛酚相当于维生素C的毫克数=

式中：C：维生素C的浓度(毫克／毫升)。

V₁：维生素C的量(毫升)。

V₂：消耗2，6－二氯酚靛酚的量(毫升)。

(4)白陶土脱色。

操作步骤

1．样品液的提取：准确称新鲜样品10克，置研钵中加入%HCl5～10毫升。充分研磨提取，如此研磨提取3次，将三2次提取液转入离心管，3000转／分离心10分钟。将上清液移入50毫升容量瓶中，最后用2%HCl溶液定容至刻度。

2．脱色：若有色样品提取液的颜色影响滴定终点的观察，可用白陶土脱色。将20毫升样品提取液加1克白陶土，振摇5分钟，离心(3000转／分10分钟)。取上清液滴定用。

3．滴定：取50毫升锥形瓶，加入样品提取液5毫升，用2，6－二氯酚靛酚溶液滴定，直至出现微红色30秒钟不褪色为终点(滴定宜迅速以减少还原型维生素C的氧化)。

4．计算：

每100克样品中维生素C毫克数(VC毫克数／100克样品)

式中：V：滴定时用去的2，6－二氯酚靛酚溶液毫升数；

T：1毫升2，6－二氯酚靛酚相当于维生素C的毫克数；

W：滴定时所取的滤液中含样品的克数；

(如取样品10克。提取液定容至50毫升，滴定时取5毫升，此提取液相当于1克样品)。

方法二：2，4－二硝基苯肼法测定维生素C含量。

维生素C又称抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型(氧化型)抗坏血酸和二酮古洛糖酸。2，4－二硝基苯肼比色法用于测定抗坏血酸总量。

将样品中的还原型抗坏血酸氧化成脱氢型抗坏血酸。在pH5以上时，脱氢抗坏血酸发生分子重排，其内脂环裂开生成二酮古洛糖酸。

二酮古洛糖酸与2，4－二硝基苯肼偶联生成红色的。其呈色的强度与二酮古洛糖酸浓度成正比，可进行比色测定。

试剂

(1)1．9N硫酸溶液：取浓硫酸(比重1．84)25毫升缓慢倾入70毫升蒸馏水中，冷却后定容至100毫升。

(2)2%2，4－二硝基苯肼溶液：称2克2，4－二硝基苯肼溶于100毫升9N硫酸中。冰箱保存。

(3)9N硫酸溶液：取浓硫酸250毫升，缓慢倾入750毫升水中，边加边搅拌。

(4)2%草酸溶液；称20克草酸，溶于700毫升蒸馏水中，定容至1000毫升。

(5)1%草酸溶液：取500毫升2%草酸溶液定容至1000毫升。

(6)1%硫脲：称5克硫脲溶于500毫升1%草酸中。

(7)2%硫脲：称10克硫脲溶于500毫升1%草酸中。

(8)85%硫酸溶液：取900毫升浓硫酸(比重1．84)小心加入100毫升蒸馏水中。

(9)标准抗坏血酸溶液：称100毫克，纯抗坏血酸溶于1%草酸中，然后定容至100毫升。

(10)酸处理活性炭：称100克活性炭，加1N盐酸750毫升，在沸水中廻流1～2小时，过滤，用蒸馏水洗涤数次至滤液中无高价铁离子为止(即用1%硫氰化钾溶液试验不呈红色为止)。于100～120℃烘干备用。

操作步骤

1．标准曲线的制作

(1)取标准抗坏血酸溶液(1毫克／毫升)25毫升，置锥形瓶中，加活性炭0．1克，振摇1分钟，过滤。取滤液10毫升，置50毫升容量瓶内，加入0．5克硫脲，待溶解后用1%草酸溶液定容至刻度，混匀(此液为200微克／毫升)。

(2)另取10毫升容量瓶5个、编号。依次加入上述稀释液0．1，0．2，0．4，0．8，1．2毫升，并各用1%硫脲溶液稀释至刻度，混匀。各瓶内抗坏血酸的浓度分别为每毫升2，4，8，16，24微克。

(3)取6支试管，其中1个加上述任一浓度抗坏血酸稀释液4毫升为空白管。其他5支试管为测定管。编号，依次加上述各浓度抗坏血酸稀释液4毫升。

然后在每个测定管内加入2%2，4－二硝基苯肼溶液1毫升，连同空白管一起置37℃温箱保温3小时。

3小时后，将测定管置冰水中，空白管冷至室温后加入2%2，4－二硝基苯肼溶液1毫升，在室温下放置10～15分钟后再放在冰水中冷却。

于冰浴中，各管分别加入85%硫酸5毫升，边滴边摇试管，在冰浴中停1分钟后，取出，在室温下放置30分钟，然后在490nm波长下进行比色，测定光密度。

(4)以光密度为纵坐标，抗坏血酸浓度(微克／毫升)为横坐标，绘制标准曲线。

2．样品液的制备：准确称样品50克和2%草酸溶液50克，置匀浆器内捣成匀浆，称匀浆20克用1%草酸稀释至100毫升，过滤或离心。

3．成和比色：吸取滤液25毫升，加活性炭0．1克，振摇1分钟，此时还原抗坏血酸氧化成脱氢抗坏血酸，过滤或离心。

准确吸取氧化后的滤液10毫升于试管内，再加2%硫脲10毫升，混匀。

取试管2个／标明空白和测定管，再各加入上述稀释液4毫升。

在测定管中加入2%2，4－二硝基苯肼溶液1毫升，连同空白管一起置37℃温箱中保温3小时。

3小时后，将测定管置冰浴中，空白管冷至室温后加入2%－2，4二硝基苯肼溶液1毫升，在室温下放置10～15分钟后再放在冰水中冷却。

在上述各管中缓慢滴加85%硫酸5毫升，边滴加边摇动试管，加完后再停1分钟，使温度不致升高。

将试管从冰浴中取出，在室温下放置半小时，然后在490nm波长处进行比色，测其光密度值。

4．计算：

式中：R：从标准曲线查出的每毫升测定液中所含总抗坏血酸的微克数。

W：每毫升稀释液中所含样品克数。

〔注〕加硫酸显色后，可随时间的延长而加深，因此必须掌握比色时间，恰到半小时比色才较准确。