脊髓再生研究进展
出处：按学科分类—医药、卫生 中山大学出版社《脊髓损伤》第501页（13989字）
传统观点认为，中枢神经系统损伤后由于自身的再生能力差和外在环境抑制，神经不能再生。脊髓是中枢神经系统的重要部分，发育成熟的脊髓损伤后神经不能再生是功能永久丧失的主要原因。研究表明，如果能创造一个适合神经元存活和突起生长的微环境，损伤脊髓的再生修复将成为可能。为促进脊髓神经的再生，各国学者所采用的方法主要集中在以下几方面：①神经营养因子的应用；②拮抗生长抑制因子的应用；③电刺激的应用；④外周神经移植；⑤雪旺氏细胞(Schwann cells，SCs)移植；⑥胚胎组织移植；⑦嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植；⑧神经干细胞移植；⑨基因治疗。
一、神经营养因子的应用
神经营养因子(NTFs)是神经再生的促进因素，可支持外周神经的再生，而早在1963年Scott和Liu就证实神经营养因子在中枢神经系统中也起作用。由于不同家族营养因子其受体分布和信号传导通路不同，不同的神经系统神经元轴突再生依赖特殊的因子。Bregman等在成熟的脊髓半横切或全横切损伤模型中使用NTFs，显示其具有显着的预防成熟CNS神经元萎缩、促进皮质脊髓束和红核脊髓束再生的作用。由于NTFs都为蛋白质，不能穿过血－脑屏障，在脊髓再生过程中要得到这些因子的持续释放，可通过利用经基因修饰的细胞如成纤维细胞、神经膜细胞等的移植，达到在宿主CNS内持续分泌所需要的神经营养因子，促进感觉神经、去甲肾上腺能神经及运动神经轴突的生长。有研究显示，在大鼠脊髓背索损伤后用可分泌NT－3的移植细胞治疗，神经功能有部分恢复。SCI后残存轴突脱髓鞘作用是神经功能丧失的原因之一。McTigue等分别将分泌NT－3、BDNF、CNTF、NGF和bFGF的经基因修饰的成纤维细胞移植到挫伤的成年鼠脊髓中，结果显示含NT－3和BDNF的移植物中有较多的轴突生长，而且这两个因子有显着的诱导少突胶质细胞增生并促进再生轴突的髓鞘形成作用。糖皮质激素、白细胞介素1、白细胞介素4、白细胞介素6等细胞因子、白血病抑制因子(LIF)具有神经保护及增强NTFs的作用。Blesch等将经基因修饰的能分泌高水平LIF的成纤维细胞移植治疗成年鼠脊髓损伤，发现宿主组织中NT－3表达明显增强，并认为LIF直接或间接地在分子和细胞水平调节CNS对损伤的反应。
二、拮抗生长抑制因子的应用
神经突起生长抑制因子的作用是神经营养因子等不能克服的，尽管上述方法明显地促进了神经元的存活和神经突起的再生，但再生的长度却很有限。神经突起生长抑制因子的抗体和神经营养因子联合使用，大大地增强了损伤纤维的出芽能力。
Schwab等首先通过大剂量的放射线照射造成脊髓神经元轴突脱髓鞘，然后再损伤脊髓，发现损伤的轴突可以成功再生，进一步证实生长抑制因子(growth-inhibiting factors)存在于少突胶质细胞和脊髓磷脂中，外周神经轴索则没有发现。并证实其抗体为IN－1。经离体培养证实IN－1可有效拮抗生长抑制因子抑制轴突生长的活性。在成年鼠脊髓损伤的动物模型中，应用IN－1可促进皮质脊髓束从远端向受损区生长，并可长出5～18mm，对照组生长1mm。而且，应用抗体还可刺激运动功能的恢复。联合应用IN－1和NT－3可促进皮质脊髓束的再生。现认为磷脂相关蛋白是一组能影响轴突再生的生长抑制分子。在轴突生长过程中，其远端的发育受多种化学因子的调节和诱导，包括分泌性蛋白，如netrin、semaphorin、collapsin、膜结合蛋白、细胞外基质分子，这些因子可抑制轴突的生长。脊髓损伤后产生的瘢痕组织学检查可见大量的蛋白胶原，其抑制轴突的生长，表明胶质瘢痕对再生有化学性阻碍作用。
三、电刺激的应用
目前应用电刺激促进脊髓再生的研究显示，电场刺激可促进轴突的生长。外周神经实验已证实，直流电场可促进轴突向着负极的方向快速生长。在中枢神经系统中，发现脊髓背侧横断的神经轴突在头端电极产生电场的刺激下，生长可加速，即使延迟治疗仍然有一定的效果。还有研究显示电刺激可使大鼠T1脊髓压迫动物模型的功能恢复。在电流刺激脊髓的动物模型中应用神经解剖示踪技术发现，许多横断的背侧轴突投射到损伤平面，只有少数的神经轴突可穿过胶质瘢痕组织，对照组无此表现。电流刺激轴突生长的现象有许多机制，电场可直接影响轴突的受体，促进神经轴突尖端的钙离子内流。另外可能的机制包括引起胞外基质分子的改变，它们与生长轴突的相互作用，胶质细胞定向性的改变，创伤后脊髓血流或神经实质的改变。另外，形态学方面的研究发现，电针刺激不仅使脊髓中神经纤维终末的面积增大，而且通过促进完好神经纤维侧枝出芽而使突触终末数量得以明显恢复。近年来的研究显示，针刺可诱导c-fos、c-jun两种原癌基因的表达和蛋白的合成，这些蛋白作为核信使，可启动和调控某些具有特殊功能意义的靶基因(如NGF基因)的表达，进而对神经元的生长、分化和神经纤维再生起重要作用。
四、外周神经移植
神经移植实质上是有生长潜能的神经元或／及其微环境因素对受损神经组织的急性替代；提供细胞、因子等功能物质促进轴突成活和再生，或在受损神经元与其靶细胞之间人为搭桥，以利于重建神经联系。周围神经含有SCs和NGF，可以为脊髓再生提供所需的微环境，同时移植的周围神经对损伤脊髓两端的再生连接起到了一个有效的桥梁作用，可引导再生轴突延伸较远的距离。
大量实验表明，将周围神经植入成年哺乳动物损伤的脊髓内，不仅可诱导和促进脊髓再生，并且再生的轴突可沿着周围神经桥延伸较远的距离。Richardson等在大鼠脊髓横切伤的软脊膜下植入自体坐骨神经，发现来源于脊髓神经元的轴突可再生穿越移植神经和脊髓之间的交界处，并长入移植神经约10mm。David等的实验显示神经元长出轴突长20～30mm。Richardson认为，脊髓神经元能否再生与损伤部位至细胞体的距离有关，当损伤的轴突距脊髓内神经元胞体超过5cm时，即使改变脊髓局部的生长环境，也难以有轴突再生。Mossonnier等在狗的脊髓损伤处植入自体周围神经，通过逆行示踪显示，再生运动神经元轴突在移植物内延伸的长度可达10cm。Cheng等的实验是在大鼠T8节段切除5mm的脊髓，造成完全横断脊髓损伤，然后采用多根肋间神经桥接损伤的脊髓间隙，通过肋间神经将脊髓的白质与灰质相连接，并用含有酸性成纤维细胞生长因子(acid fibroblast growth factor，aFGF)的纤维蛋白胶固定。实验结果与对照组相比较，用肋间神经桥接的大鼠的损伤脊髓有轴突再生，行为恢复较好，大鼠后肢功能从术后3周开始恢复并延续1年，组织学检查证实有运动神经元再生的证据。虽然只研究了4只移植大鼠，但却首次令人佩服地证实在大鼠完全横断的脊髓中轴突具有功能性再生。这项研究是一个重要的里程碑，为实验性修复成年哺乳动物脊髓损伤提供了有力的证据，并显示出良好的开拓前景。
外周神经移植入损伤的中枢神经系统，可使损伤部位的中枢神经元细胞轴索再生出较长的距离。然而，研究发现轴突生长常停止在接近移植神经的远端，移植神经内的轴突不易穿过移植物下端的界面。即使有一些轴突穿过了移植界面，却很少超过2mm。有人认为这是由于在移植早期，周围神经中含有NGFs，而且损伤部位还未出现明显的胶质增生反应。但随着移植神经内NGFs的减少或消失，加之局部胶质瘢痕组织的形成，限制了移植物再生轴突的延长，穿过界面的能力减弱。另一种可能是脊髓损伤的残端过早过快地出现广泛的新芽，使产生释放NGFs的细胞受到抑制，神经再生终止。
五、雪旺氏细胞(Schwann’s cells，SCs)移植
尽管通过移植周围神经能在一定程度上促进中枢神经再生，但如果将周围神经反复冻融消除其细胞成分(主要是SCs)，则对中枢神经的促进作用明显减弱，提示SCs在神经轴突再生中发挥关键作用。SCs是周围神经胶质细胞，功能主要有：①分泌神经营养因子，如NGF、脑源性神经营养因子(BDNF)、睫状神经营养因子(CNTF)及FGF等，维持神经元的存活并促进神经突起的生长；②稳定和保护损伤区变性的组织，减少对损伤的反应；③产生细胞外基质成分(extracellular matrix，ECM)和细胞粘附分子(cell adhesion molecules，CAM)分别与生长锥表面相应受体结合，为轴突再生提供良好的环境，同时支持和引导轴突再生。由于SCs具有较强的促进神经再生的作用，因此近年来，利用SCs移植促进CNS再生的研究日益活跃。
Ramony Cajal认为，SCs能促进周围神经轴突再生长，引导并支持其再生。在华勒变性发展过程中，新生的SCs重新进入神经束中残留的基膜管，形成Btingner带。再生的轴突不仅需要Bungner带的结缔组织引导，也需要沿轴突生长通路存活的SCs的支持。中枢神经系统所以不能再生正是缺少这种在周围神经系统存在的支持细胞。
脊髓的血管周围间隙属于结缔组织，含胶原原纤维及成纤维细胞，脊髓的小动脉及毛细管前血管周围间隙有成熟的SCs包被神经外膜基板，同时包被无髓鞘的轴突。
脊髓横断后，中枢神经系统周围界限遭到破坏，其反应形成一个新的胶质基板，以覆盖断端的中枢神经系统裸露面。在切断的断端胶质基板内，电镜下偶尔可以看见SCs，有少数轴突使中枢神经系统与结缔组织发生连结。在脊髓侧，轴突覆以星形细胞或少突胶质细胞；但在结缔组织侧，同一轴突则覆以SCs。Blakemore(1982)发现脊髓受压、脊髓横切、多发性硬化及X线照射均可见到雪旺氏细胞侵入中枢神经系统，其来源可能为：①脊髓的血管周围间隙，靠近神经根进入处；②在脊髓横切时来自受损的背侧神经根；③中枢神经系统原先存在原始的多能间叶细胞。
再生的中枢神经元表面表达大量的细胞粘附分子NCAM和L1，主要位于神经元与SCs相接触的膜之间。SCs表面表达的NCAM和L1是促进中枢神经元再生通过移植物的关键物质。NCAM一方面通过直接粘附作用引导神经元，还通过第二信使的级联放大在细胞生理方面产生多种效应，如加强微管蛋白的聚合、稳定细胞骨架、促进轴突延伸等。
大量实验证实，在脊髓损伤部位植入SCs后，能支持和促进脊髓神经轴突再生，同时SCs还可使损伤后结构连续但发生脱髓鞘的轴突重新髓鞘化，其产生的髓磷脂包绕神经轴突，从而恢复电传导能力。但目前观察到再生的轴突很少能长入损伤区另一侧脊髓，考虑可能是因为移植的SCs在局部的迁移距离非常有限。应用硝酸过氧化乙酰／聚氯乙烯(PAN／PAC)渗透管并在其内种植SCs，将其移植于脊髓损伤部位，发现其中生长轴突的数量和长度均优于单纯PAN／PAC管而未种植SCs者。
Martin等将单纯的SCs悬液移植于大鼠脊髓损伤腔内，3周后发现轴突长入移植物中，同时损伤腔隙缩小，胶质瘢痕减轻。Kuhlengel等将含有SCs和脊神经节细胞的混合物移植于新生大鼠脊髓的损伤腔，未发现轴突长入移植物中，这表明单纯的SCs对轴突的再生起促进作用，而SCs和脊神经节的混合物对再生起负调控作用。同时Martin对移植SCs的最佳时机进行研究发现，在脊髓损伤的同时注入雪旺氏细胞，该细胞存活良好，星形胶质细胞数量减少；当移植物注入延迟时，星形胶质细胞已大量产生，动物的功能恢复不良。
六、胚胎组织移植
胚胎神经细胞可较长时间存活，其再生能力较强。国内外研究发现，在成年大鼠，用胚胎脊髓组织植入SCI处，其轴突能长入胚胎移植物中，并可改善神经功能。Bregman认为，胚胎移植物具有良好的生长潜力，可起到轴突生长的接力站的作用。宿主轴突先长入胚胎脊髓移植物中并与其神经细胞发生联系，再由胚胎神经细胞的轴突长入远侧脊髓的宿主细胞而发挥功能。近来有学者将骨髓干细胞与神经生长因子混合进行特殊培养，发现骨髓干细胞能诱导分化成神经细胞，这为SCI患者进行自身神经细胞移植提供了可能。
近年来，有大量的胚胎脊髓组织(FSC)脊髓内移植研究报道，胚胎鼠脑或脊髓组织移植到新生鼠或成年鼠的损伤脊髓中能够成活和分化，成活率高达90%，且与宿主脊髓紧密融合，可以挽救部分损伤退化的神经元。损伤的轴突在FSC中可生长较长距离，表明胚胎脊髓组织富含神经营养物质，同时，植入的胚胎组织还有桥接损伤纤维断端的作用，但不含神经突起生长抑制因子。脊髓损伤后，移植组织可以从几个方面来促进脊髓的恢复，移植脑干细胞包含有特殊的细胞群(红核和Locusceruleus)，能产生一系列神经递质(serotonin，noradrenaline)，如5－羟色胺和去甲肾上腺素；移植组织提供了能使损伤轴突髓鞘化的胶质细胞；释放神经营养因子阻止去轴突的神经元逆行性细胞死亡；脊髓移植可为再生的轴索提供桥梁，有证据表明胚胎移植可减少宿主与移植物界面的瘢痕形成。动物模型功能的恢复可能是由于胚胎移植物可使神经元与宿主轴突形成突触，传递神经信号；同时提供可形成受损轴突髓鞘的胶质细胞。移植胚胎神经组织在新生鼠的中枢神经系统取得了成功，组织学检查证实有大量的轴突再生并穿过损伤区，支配远端的神经元，动物功能也得到理想的恢复。Diener提出质疑，认为这种神经功能的恢复主要是由于宿主处于幼年状态，其轴突可穿过移植物。而将胚胎神经组织移植入成年鼠的脊髓，其效果就明显不如新生鼠。尽管宿主神经元能长入供体的移植物组织，它们并不穿过该组织。供体神经元可长出移植物，但进入宿主组织的距离很短。胚胎细胞悬液注入脊髓的挫伤处，未见明显的功能恢复。成年动物受损神经元的生长需要多种因子来促进，NT－3可明显促进轴突长入移植物。BDNF可促进非肾上腺素能神经元和5－HT能神经元轴突长入移植物。
胚胎脊髓移植物可抑制脊髓损伤区胶质瘢痕形成，减少形成的胶质瘢痕，促进再生轴突穿越胶质“屏障”，对脊髓再生有明显的促进作用，并与宿主脊髓融合恢复其解剖上的连续性。此外，还有以下作用：①营养和诱导作用，减轻脊髓损伤后神经元的逆行性溃变、坏死，促进轴突再生并重新髓鞘化；②代替作用，代替某些脊髓节段缺失的神经元，发出轴突，恢复神经的感觉、运动和反射功能；③可作为连接损伤脊髓两断端的”桥状结构”或”中继结构”，支持并引导再生轴突穿越损伤区或与再生轴突构成突触联系，传导信息。
已有胚胎脊髓移植应用于临床的报道，发现患者的神经症状均有一定程度的改善，但目前现有的临床经验还不足以支持胚胎CNS移植的确切临床价值。
七、嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells，OECs)移植
嗅鞘细胞(OECs)是一种存在于嗅球(OB)的特殊类型胶质细胞，具有雪旺氏细胞和星形胶质细胞的双重性质，可伴随嗅神经轴突由周围神经系统进入中枢神经系统。嗅上皮神经元具有独特的性质，它终生具有更新能力，并且可以长出轴突在OECs的伴随下由周围神经系统长入成熟的抑制性的中枢环境。在嗅球内，OECs是惟一接触和包被嗅神经轴突的胶质细胞。在整个中枢神经系统通路中，它包被嗅神经轴突，以防止轴突与其他中枢神经系统细胞接触，可使轴突通过交界区由周围神经系统进入中枢神经系统。OECs所处的位置及与轴突的联系方式揭示了其在嗅神经轴突再生中的关键作用。
OECs在其膜上表达出很多与细胞粘合和轴突生长相关的分子，如调控嗅神经轴突延长的L1样细胞粘附分子基因(L1)、神经细胞粘附分子(NCAM)、层粘连蛋白(laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、促进神经生长因素的分子源自于胶质细胞的nexin和S100。OECs能分泌大量不同种类的神经营养和支持因子，如血小板源生长因子、神经肽Y、神经生长因子、脑源性神经营养因子、神经营养因子－3和神经营养因子－4等。Anthony等通过数字时间成像发现，移植早期，OECs显示了快速且多样的形变能力，包括形变为小圆形、大扁平形、纺锤状的SCs形以及多极形细胞，而同种环境下的其他神经细胞的形态相当稳定。提示OECs能适时地改变自身形态以适应复杂的微环境。毫无疑问，嗅鞘细胞的这些特性为神经再生建立了良好的微环境。
已有的研究表明，应用神经营养因子、拮抗生长抑制因子、电刺激、外周神经移植、胚胎组织移植及SCs移植等方法都能不同程度地促进神经轴突再生，但都不能达到瘫痪肢体功能恢复的最终目的。Ramon-Cueto实验小组应用嗅鞘细胞成功桥接完全横断的大鼠脊髓，证实去甲肾上腺素能纤维、5－羟色胺能纤维及皮质脊髓束纤维出现长距离的再生，长入对侧脊髓断端并有显着的功能恢复。其他研究者在脊髓部分损伤后移植嗅鞘细胞，发现一方面嗅鞘细胞可以提供轴突再生长过损伤区的良好环境，另一方面它们也有可能形成新的髓鞘，虽然由于雪旺氏细胞的存在这些髓鞘的来源还难以确定。Kato及Barnett的实验小组分别报告了人嗅鞘细胞的获得及纯化，并在植入成年大鼠脊髓脱髓鞘区后提示可形成髓鞘包裹脱髓鞘的轴突。大量的研究表明，OECs移植不但能促进损伤脊髓轴突再生，还能促进动物瘫痪肢体的功能恢复。
初期所有有关OECs的研究主要集中在啮齿类动物各种不同脊髓损伤模型。Ramon-Cueto等首先报道了成年大鼠脊髓单侧脊神经根切断术后OECs移植促进损伤轴突再生的能力。在此研究中，T8平面脊髓的单侧脊神经根自脊髓入口处被切断，以显微外科技术吻合于原处，随后在神经根入口位置注入OECs。3周后观察到脊神经根轴突重新进入脊髓，穿越了周围神经和中枢神经的边界。5年后Navarro等进行了多节段腰髓及骶髓的双侧神经根切断术后OECs移植促进损伤轴突再生的能力观察，再一次论证了上述结果。Li等将大鼠C1～C2间用电解作用选择性地破坏脊髓单一神经通路——皮质脊髓束，并植入OECs，观察到OECs能明确地促进轴突再生。与移植SCs比较，移植OECs长入脊髓远端的能力更强。
Romon等在脊髓横断损伤模型观察到，OECs能促进轴突长距离的再生，再生轴突穿越了胶质瘢痕区，进入脊髓远断端后可生长3cm。截瘫的大鼠恢复了后肢的自主活动，能完全伸展并支撑体重，后肢轻触觉及本体感觉有恢复。还有许多学者都曾用半横断模型进行上述研究，得到了同样的结论。沈慧勇等在国内率先进行了OECs移植修复脊髓损伤的系列研究，证实当OECs被移植入成年鼠的脊髓损伤区内，它们能与宿主神经实体组织结合为一体，诱导再生轴突穿过抑制屏障长入远端。之后又进行了OECs延迟植入打击伤的成鼠胸髓组织的研究，更与临床实际情况相符合，且得到了相同的结论。低温保存OECs移植对脊髓轴突再生影响的研究发现，低温保存过的OECs移植后与宿主融合良好，低温保存降低了移植物的抗原性，保存时间对移植物的存活和生长没有影响，为临床上采用冻存的OECs移植修复急性脊髓损伤提供了参考依据。上述研究表明无论是选择性的神经通路损伤还是复杂的脊髓损伤，OECs移植都能促进损伤脊髓轴突再生和肢体功能恢复。但对于脊髓挫裂伤的修复能力尚存在一定争议。研究还发现，延迟移植(伤后4周)OECs同样能促进脊髓损伤的修复。表明OECs移植在脊髓亚急性损伤的修复方面可能也是一种可行的方法。
Franklin等报道OECs通常并不产生髓磷脂，但无论在体内还是在体外，均可使脱髓鞘的轴突重新获得髓鞘，再生轴突周围有髓鞘碱性蛋白表达。在神经脱髓鞘的情况下，OECs能帮助神经髓鞘化，从而加速神经电生理传导速度，为中枢神经脱髓鞘疾病的治疗建立了实验基础。
前已述Li等用电解作用选择性地破坏脊髓单一神经通路，观察到OECs明确的促进轴突再生作用。Verdu(2001，2003)先后报道了脊髓光化学损伤后，OECs移植对脊髓的形态和功能有保护作用，并促进轴突再生。表明不同性质的脊髓损伤对OECs移植都有良好的反应。
对于人OECs是否也具有大鼠OECs的特性及功能，Imaizumi(2000)、Guest、Bemal(2002)做了相关研究，证实了猪、灵长类动物OECs有着同大鼠OECs相似的特性。Kato等将从成年人嗅神经提取的OECs植入已抑制免疫反应的大鼠脱髓鞘白质，结果表明，脱髓鞘神经广泛髓鞘化。
近年来，研究人员采用神经生长因子基因修饰成纤维细胞或Schwann细胞后再植入鼠的脊髓损伤区，发现有显着的轴突再生。表明神经营养素家族(NGFs)基因修饰的移植细胞可作为SCI轴突再生的工具。OECs的作用广泛、活跃，而且分泌神经营养和支持因子的功能很强，但是其分泌量有限。因此OECs作为一种理想的受体细胞用于SCI的基因治疗是很有临床意义的。可以将外源性诱导刺激神经元轴突再生生长因子(NT－3、BDNF、L1等)的目的基因整合于OECs的基因组中，经过转染的OECs生物学作用相对以前更强，和目的基因的表达双重作用于受损伤的神经组织，可以进一步改善受损神经的微环境，提高神经再生及功能恢复程度。杨浩等将人睫状神经营养因子经逆转录病毒载体转染OECs，发现其对神经元存活和轴突生长具有显着的促进作用。
在脊髓损伤修复过程中，神经元的作用是不可忽视的。OECs移植后分泌大量不同种类的神经营养和支持因子，支持脊髓神经元的存活，挽救损伤运动神经元，并促进损伤神经元的修复，同时减少CNS损伤后兴奋性毒素的释放。目前的研究多注重轴突的再生，沈慧勇等正在进行神经干细胞与OECs联合移植修复SCI的实验研究，希望能更好地修复脊髓功能。
脊髓是相对的免疫“豁免区”，胚胎组织的免疫原性低下。我们近期的研究发现，人胚胎OECs与移植免疫排斥发生密切相关的表面标志HLA-DR、CD80、CD86、CD40和CD40L均为阴性，与人骨髓间充质干细胞相类似，提示OECs也是一种免疫原性低下的细胞。沈慧勇等用液氮低温保存人胚胎OECs，并首先将复温后的OECs用于急性脊髓损伤的患者。黄红云等将OECs移植应用于脊髓陈旧性损伤的患者，初步结果表明脊髓神经功能有不同程度的改善，且呈继续改善趋势。澳大利亚的AlanMackay-Sim也在积极招募志愿者进行临床试验。
OECs的特性是用它来促进脊髓轴突再生的理论基础。在实验条件下移植培养的OECs能使成熟的轴突再生，可治疗哺乳动物不同类型及不同性质的脊髓损伤，为将来的临床应用奠定了基础。OECs可以从成人的嗅觉系统内得到，使自体移植成为可能，将来可能会成为治疗脊髓损伤的一种方法。但自体移植要求时间长，不可能应用于急性脊髓损伤。目前OECs移植仍存在一些问题。第一，OECs修复脊髓挫裂伤的能力尚有争议。如果将挫裂伤后坏死、液化以及瘢痕化的组织清除，以外周神经桥接于缺损区并联合OECs移植，可能是一种可行的方法。第二，OECs的取材、培养、纯化等方面条件要求严格，使来源受限，不能满足实验需求，特别是人OECs的取材困难，使临床应用进展缓慢。细胞建系将使这个问题迎刃而解，可能会成为将来研究的热点之一。第三，OECs移植后长入远侧脊髓的轴突数量和质量距临床修复的要求还相差很远，基因工程等方法可望解决这一问题。另外，目前有关OECs的作用机理，尤其是移植后与日益引起重视的抑制因子的关系还不清楚。近几年，神经干细胞移植修复脊髓损伤方面也取得了一定的进展，建立了初步的动物实验基础，OECs联合神经干细胞移植以及联合基因治疗将为我们展现良好的前景。
八、神经干细胞移植
神经干细胞(neural stem cells，NSCs)是一种长期储存于中枢神经系统中、具多潜能、处于未分化状态、能够自我更新复制的细胞，其进一步分化可产生神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞等神经系统成熟的细胞。在哺乳类胎儿，NSCs主要位于侧脑室的脑室区、室下区、海马、嗅球、脊髓。在合适的条件下NSCs可被分离、纯化，被移植回中枢神经系统后，它能进一步迁移、分化，并与宿主神经元整合发挥神经功能。
神经干细胞体外培养采用无血清悬浮培养技术，从中枢神经系统中确定有细胞分裂的部位切取部分组织，在含有有丝分裂原(bFGF和／或EGF)的培养液中孵育增殖，诱导干细胞向不同的子代细胞分化，通常通过检测nestin蛋白(位于多能神经外胚层细胞胞浆中的中间丝蛋白)来确定神经干细胞的存在。NSCs不仅存在于不同胚胎发育期哺乳动物，脊髓中央管的室管膜细胞就是神经干细胞，在脊髓损伤后能通过不对称分裂增殖，并向损伤区移行来进行损伤修复，但多数情况下分化为胶质细胞参与胶质疤痕的形成。因此重建损伤脊髓局部环境，诱导NSCs向神经元方向转化，成为脊髓损伤修复的一项重要内容。来源于中枢神经系统不同部位的NSCs分化能力可能相同。神经干细胞的分离培养成功，特别是神经干细胞系的建立可以解决胚胎移植的供体来源问题，为体外观察和移植研究提供了较稳定的材料。
移植的NSCs可根据宿主的微环境分化为相应谱系的神经细胞，替代或补充损伤缺失的细胞，并与宿主神经元形成突触联系，促进神经回路重建。1999年McDonald等将来源于鼠胚胎干细胞的未分化神经细胞植入鼠脊髓损伤部位，结果显示大鼠麻痹的后肢功能获得了一定的改善。Toda等的实验进一步表明神经干细胞能够形成功能性突触。
髓内移植的NSCs还可以作为基因治疗的载体，表达治疗性因子以维持细胞存活和促进轴突再生。Liu等将经表达NT－3的、基因修饰的NSCs植入到脊髓无损伤的免疫抑制鼠中，结果显示基因修饰的NSCs细胞移植前后均能高效表达NT－3；植入的细胞至少可存活2个月，并分化为神经元和胶质细胞。因此使用基因修饰的神经干细胞移植修复脊髓损伤不仅能替代退变死亡的细胞，而且能够在损伤部位产生高水平的治疗因子，从而促进局部神经通路的重建，改善肢体功能。因此转基因神经干细胞移植也是脊髓再生研究的一个新的方向。
九、基因治疗
基因治疗是指通过分子生物学技术和细胞转移技术，将特定的DNA片段转移至特定靶细胞，使DNA在这些细胞中得到表达，并合成蛋白，发挥生物学效应。脊髓损伤的基因治疗是近年来脊髓损伤研究的一个热点，即将准备移植入脊髓的细胞进行基因修饰使其表达脊髓损伤修复所需的治疗性基因产物(如神经营养因子、粘附分子等)，进而发挥生物学效应。神经营养因子在脊髓再生过程中起重要作用，但由于其来源困难、半衰期短、组织含量低、不能通过血脑屏障等原因，常规途径应用疗效不满意。转基因技术的发展使神经营养因子在脊髓再生过程中发挥长期、高效的作用。此外尚有一些与脊髓损伤后可塑性反应有关的细胞内、外因子和神经递质的转基因研究也有报道。
1994年Tuszynski等首次将经神经生长因子(NGF)基因修饰的成纤维细胞植入无损伤的鼠脊髓中，1年后植入的成纤维细胞仍存活，并促使大量的脊髓感觉轴突生长。电镜检查发现大量轴突被神经胶质细胞层包裹形成髓鞘。这一结果给人们研究脊髓损伤治疗提供了新的方向和希望。Mark等于1996年将经NGF基因修饰的成纤维细胞植入大鼠胸段脊髓损伤模型中，可以观察到脊髓运动、感觉和去甲肾上腺素能轴突的再生。1999年Liu等将BDNF基因修饰的成纤维细胞植入大鼠脊髓损伤处，结果促进了红核脊髓神经纤维的再生，鼠前肢功能有显着的改善。
脊髓损伤基因治疗多选神经营养因子(如NGF、BDNF、NT－3、CNTF、GDNF．)的基因为目的基因。病毒常被用做携带基因的载体，其中腺病毒较为常用，因其具有可感染不具分裂能力的CNS神经元、致病性小、且能逆行运输等特点，但可能诱发免疫反应；伴腺病毒的优势在于它可整合进非复制细胞，但缺乏天然的嗜神经元性，基因转染率较低；疱疹病毒亲神经元，基因转染率高，是CNS基因治疗的潜在工具；逆转录病毒，如乳腺病毒、劳斯肉瘤病毒、莫洛氏鼠白血病病毒等，基因转染率高，常用于离体转移法基因治疗，但这类病毒也不能整合进非复制细胞。
目前，基因转移主要有两种方法：离体转移法(exvivo approach)和活体直接转移法(invivo approach)。
(1)离体转移法是在体外先对适当的细胞进行遗传修饰，使其能表达分泌特定的基因蛋白，然后将载体细胞移植到脊髓内，持续表达释放所需物质，改善损伤局部的微环境以促进再生修复。载体细胞可取自宿主，在体外可筛选高表达细胞克隆，有效地控制移植细胞的数量和质量。实验中常用的载体细胞有：①雪旺氏细胞：将NGF基因修饰的雪旺氏细胞移植入损伤脊髓内，细胞在体内能稳定地表达NGF，挽救切断的多巴胺神经元并促进轴突的再生。雪旺氏细胞不仅可作为转基因的载体，而且本身还能分泌多种营养因子，促进髓鞘重建和部分神经功能的恢复，因此具有其他载体所没有的优势，在基因治疗中日益受到重视。②成纤维细胞：由于成纤维细胞易于获取、在体外容易繁殖而得到广泛应用。利用来源于莫洛氏鼠白血病的逆转录病毒载体，将NGF基因导入成纤维细胞中，再将细胞植入半横贯损伤的脊髓，一年后成纤维细胞仍能表达NGF，脊髓中大量的感觉、交感、运动性神经轴突再生。经BDNF修饰的成纤维细胞也有类似的作用。③成肌细胞：成肌细胞可以从个体中获取，实现自体移植。此外，这种非神经元细胞的基因载体，可以通过化学或病毒方法被有效广泛地转染。经修饰后的成肌细胞，植入脊髓后可长期表达转移基因。但其稳定性和致癌性尚需研究。④星形胶质细胞：近期研究显示，在体外，基因修饰的星形胶质细胞可以表达高水平的NGF或BDNF，因而成为一种大有希望的转基因载体。⑤神经干细胞：神经干细胞较上述非神经细胞载体的优点在于，它不仅可以起到基因载体的作用，而且可以被诱导分化成特定的神经元，并与宿主建立突触联系。因此转基因神经干细胞的移植将成为一种强有力的治疗脊髓损伤的手段。
(2)活体直接转移法是利用适当的重组病毒或化学基因转移载体，将目的基因直接传递到体内的方法。其中在组织中直接注射含有目的基因的阳离子脂质体的方法较为有效。但由于转移效率较低，较少采用。
转基因技术一方面越来越广泛地用于将促进脊髓可塑性的因子带入脊髓内；另一方面，若能同时通过该技术把抑制因子抗体的基因片段引入脊髓，产生抗体中和抑制因子，将会取得更为理想的治疗效果。
通过基因转移的方法，可以为脊髓损伤后神经生长提供一个合适的微环境，从而使轴突再生成为可能。这是目前脊髓损伤后进行基因治疗实验研究的主要目的。
转基因技术真正能应用于临床治疗脊髓损伤，还需要解决以下问题：①免疫排斥反应：即宿主对载体细胞的免疫排斥。尽管CNS的免疫应答能力很弱，但对抗原性较强或种属相关较远的载体细胞仍具有免疫排斥反应。在细胞移植时给予免疫抑制剂，或移植自体细胞，或采用免疫隔离法，即用微囊包被载体细胞，都可在一定程度上减轻免疫排斥反应。②移植细胞的存活：宿主脊髓损伤局部的病理生理反应可能使部分移植细胞死亡，移植细胞若太多，也可能挤压宿主细胞，影响其结构和功能。采用增大细胞密度、减少移植量的微移植技术，可以减轻对宿主脊髓的损伤，也有助于延长移植细胞的存活时间。③转移基因表达减弱：随着时间的延长，转移基因的表达会逐渐减弱。用内源性或外源性调节因子主动调节转移基因的表达，可维持转移基因的表达。此外，转移基因针对特定组织的导向问题及其致癌潜能也不容忽视。