培养基的制备

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《果树育苗手册》第22页（2968字）

培养基是外植体生长的营养物质，是植物组织培养成功与否的关键因素之一(表2－1)。培养基的种类、成分直接影响到培养材料的生长，应根据外植体的种类和部位，选择适宜的培养基。培养基的成分主要包括：无机营养成分(包括大量元素和微量元素)，有机营养成分(包括氨基酸、维生素和糖)，植物生长调节剂(包括生长素、细胞分裂素、赤霉素等)，其他有机附加物(包括一些成分尚不完全清楚的天然提取物，如椰乳、香蕉汁、番茄汁、酸母提取物、马铃薯浸汁等)，在固体培养基中还需加入琼脂作为凝固剂。

表2－1 常用培养基成分表

1．器皿和用具的准备 配制培养所用的主要器具有不同型号的三角烧瓶(锥形瓶)、试管、烧杯、培养皿、容量瓶、移液管、滴管、玻璃棒、漏斗、注射器等。各种器皿、用具必须清洗干净后方可使用。新购置的玻璃器皿使用前选用1%稀盐酸浸泡一夜，然后用洗涤剂洗净，清水冲洗干净，最后用蒸馏水冲一遍，干后备用。已用过的器皿应先将残渣去掉，用清水洗净，然后再用洗涤剂洗净，清水冲洗干净，干后备用。移液管、滴管、容量瓶等由于口小不便碱洗，常用酸洗，即用酸液(40克工业用重铬酸钾经少量水溶解，然后缓慢加入粗制浓硫酸至1000毫升)浸泡一天后，取出在流水中冲洗干净后，再用蒸馏水冲一遍，干后备用。

2．母液的配制与保存 配制培养基用的水原则上应用纯水，一般用蒸馏水即可，化学药品用分析纯或化学纯，称量须准确，且应准确记录，以便日后查对。对于常用的培养基，一般先配成10倍或100倍的混合母液，贮存于冰箱内，用时再按比例稀释混合。这样使用方便，也减少工作量。通常大量无机盐类原则上可以混在一起，配成10倍浓度的母液，各种药品必须各自充分溶解后才能混合，混合时要注意先后次序，要把钙离子(Ca²⁺)、锰离子(Mn²⁺)、钡离子(Ba²⁺)和硫酸根(SO₄^2－)、磷酸根(PO₄^3－)错开，以免形成硫酸钙、硫酸钡、磷酸钙或磷酸锰沉淀。铁盐也容易发生沉淀，需要单独配制。一般用硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和乙二胺四乙酸二钠(Na₂－EDTA)配成200倍浓度的铁螯合剂，比较稳定，不易沉淀。微量元素和维生素之类可配成100倍浓度的混合母液。各种母液配好之后，于冰箱内贮存备用。现以MS培养基为例，具体讲述母液的配制方法。

(1)大量元素母液 参照表2－2，按次序进行称量、溶解、配制。配好的母液贴上标签注明母液名称，扩大倍数、日期、及配制1升培养基时应取的量。于2～4℃冰箱内贮存，最好于1个月内用完。如发现有霉菌和沉淀产生，则不能再使用。

表2－2 MS培养基大量元素母液配制法

(2)微量元素母液 微量元素用量小，为称量方便及精确起见，可配成100倍母液。参照表2－3顺序称量，分别溶解后，依顺序混合，并定容于1000毫升的容量瓶中。

表2－3 MS培养基微量元素母液配制法

(3)铁盐母液 称量乙二胺四乙酸二钠7．45克加入蒸馏水900毫升于100℃水浴中充分溶解，称量5．57克硫酸亚铁(FeSO₄·4H₂O)，逐渐倒入溶解后，使溶液冷却至室温，然后定容于1000毫升容量瓶中，置于棕色试剂瓶中保存。每配1升培养基加这样的铁盐母液5毫升。

(4)有机物母液的配制 氨基酸及维生素类物质分别用容量瓶配制成100倍的母液，在配制培养基时，每配1升培养基取10毫升母液即可。参见表2－4。

表2－4 MS培养基有机物母液配制法

(5)植物生长调节物质的配制 为使操作方便，生长调节物质也可如同配制母液一样，先配制成原液，这样配制培养基时只需稍加计算按需量取即可。原液于冰箱内保存。由于激素比较难溶解于水，所以就其溶解方法叙述如下：

①NAA(萘乙酸) 于温水中缓慢溶解。在丙酮和酒精中也能充分溶解。只用水溶解时，以50℃的水浴锅加温，并用磁力搅拌器搅拌，促其溶解。另外，NAA钠盐和钾盐，都易溶于水，使用方便。因NAA与NAA钾盐和钠盐的分子量不同，使用时需进行相应的换算。

②2，4－D(2，4－二氯苯氧乙酸) 极难溶于水。可先以少量95%酒精溶解后再徐徐加水。2，4－D粉末析出时，再同样添加酒精溶解，然后再加水。这样反复进行操作，最终得到所需的溶液。

③IAA(吲哚乙酸) IAA极微量溶于水。用与2，4－D同样的方法溶解。

④BA(6－苄基腺嘌呤) 极微量溶解于水，在酒精和丙酮中则不溶。可用与NAA同样方法使用温水，以磁力搅拌器边搅拌边经过一定时间缓慢溶解，或者先以1摩研盐酸溶解后，再缓慢加入温水。

⑤GA₃(赤霉素) 微量溶于水，极易溶于丙酮或酒精中，可用溶解2，4－D的方法配制溶液。

激动素：溶液性能及溶液配制方法同BA。

3．培养基配制程序

①称出规定数量的琼脂和蔗糖，加入蒸馏水至终体积的3／4，加热使之充分溶解。

②另取一容器，分别按规定量加入各种母液，包括生长调节物质及其他特殊附加物。如不能高压灭菌的物质，应在调节了pH之后，使用0．22～0．45微米的微孔滤器消毒。

③将②溶液倒入溶好的琼脂中，不断搅拌使其混合均匀。加入蒸馏水至培养基的终体积。

④用0．1摩／升NaOH和0．1摩／升HCl调节培养基的pH。

⑤用分液漏斗或分装器分装于事先准备好的试管或三角瓶等容器内。

⑥用封口膜、包在纱布中的棉塞或其他适宜的塞或盖封严瓶，准备灭菌。

⑦使用高压蒸汽灭菌锅于120℃(1．06千克／厘米2)下灭菌15分钟。

⑧灭菌后及时取出培养基置于平面上，使其在室温下冷却。当使用试管制备固体培养基时，应在冷却期间将试管斜置，把培养基作成斜面。