嗜血杆菌属

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第340页（3875字）

嗜血杆菌是酶系统不够完备需要生长因子才能繁殖的革兰氏阴性菌，生长因子包括X及(或)V因子。嗜血杆菌呈小到中等大的球杆状或杆状，有时形成丝状，多形性。许多菌株有荚膜，不运动。兼性厌氧，DNA分子中G+C含量为38～39，有16个种。

本属细菌常出现于人及其他脊椎动物呼吸道中，可引起畜禽发生多种疾病，包括猪流感、猪多发性浆膜炎、禽鼻炎、猪的胸膜肺炎、牛肺炎、绵羊与猪败血症，某些动物的脑膜炎、脑脓疡、子宫炎、流产、阴道炎、龟头包皮炎。

检验步骤如下。

1．样品采集 根据病的表现而采取不同的样品，可采取呼吸道分泌物，血液，流产的胎儿组织，阴道分泌物，死后的肺组织、脑组织。此菌娇嫩，样品采集后应迅速送到实验室，如用棉拭采集样品，应将棉拭放入含葡萄糖1%、血清5%、青霉素0．2u／ml、万古霉素5μg／ml的营养肉汤中迅速运送。

2．培养 此菌较难生长，普通培养基上直接划线培养不易生长，应取较多的样本接种于血琼脂、巧克力琼脂、含硫乙醇酸盐液体培养基中。在含有10%CO₂环境中生长良好。

新分离的嗜血杆菌生成圆形，整齐光滑、闪光的菌落，大小因种别、营养成分等而异，在血琼脂上18～24h小于1mm，在巧克力琼脂上24h0．5～1mm，在巧克力琼脂并接种有饲养菌(金黄色葡萄球菌)的培养基上菌落较大呈现灰色乳光。

3．鉴别诊断 巴氏杆菌易与此菌混淆，此两属细菌不仅在菌落和形态上类似，且巴氏杆菌初次分离时缺少X因子，也往往不生长。分离培养同时使用巧克力和鲜血琼脂，若细菌在巧克力琼脂上生长良好，而在鲜血琼脂上生长贫瘠或不生长，则可能为嗜血杆菌，但猪嗜血杆菌及其他要求较高的细菌，在巧克力琼脂上生长贫瘠，与巴氏杆菌相似，而与营养要求不高的流感嗜血杆菌不同。

X与V因子需要与否的试验，方法有4种。

(1)液体培养基中测定。葡萄糖蛋白胨水和已加有X或V及X+V因子的培养基中(对营养要求高的细菌如猪嗜血杆菌，猪副嗜血杆菌、鸡嗜血杆菌、副鸡嗜血杆菌尚需加入血清)，接种待检细菌，观察细菌的生长情况，培养基中含有溴甲酚紫，如生长则变为黄色，即可判断细菌对X、V因子的需要情况，如表13-4。

表13-4 用液体培养基测定细菌对X、V的需要

注：NAD为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，NAD与结晶血红素，二者均有商品，后者可耐高压，而NAD不耐热，用滤器除菌。

(2)固体培养基中测定。放含有X或V因子及X+V混放的纸条(或圆纸片)于预先接种有待试细菌的胰蛋白胨大豆琼脂或脑浸液琼脂上，37℃培养24～48h后观看结果。纸片含有该菌需要的因子时，细菌在纸片周围生长，否则不生长。

(3)无X及V因子制剂时，可将细菌分别接种于普通巧克力琼脂和经高压加热(121℃)半小时制成的巧克力培养基，并同时涂布接种于2%脉胨琼脂平皿，再用金黄色葡萄球菌作直线接种，经培养后判定结果，如表13-5。

表13-5 不同的培养基生长情况测定对生长因子的需要

* 在葡萄球菌附近有细菌生长，因为葡萄球菌能产生V因子，而此菌需要V。

(4)细菌对X及V因子的确定，还可进行较精密的试验。试验时用胨3号培养基。

确定V因子用的培养基 在温度为45～50℃时，加入过滤除菌的NAD，使每ml的含量为1μg。

确定X因子用的培养基 以2．5mg结晶血红素加入1ml0．2mol／LKOH的47．5%乙醇液，再以无菌蒸馏水稀释至5ml，在培养基中的最终浓度为1μg／ml。

接种待检菌于上述二种培养基中，37℃培养观察生长情况，决定其对X、V、因子的需要。

ALA—→卟啉试验检测对X因子的需要可取生长良好的待试菌固体培养物一浓厚的接种环，浮悬于0．5ml的试液中［试液为0．1M的磷酸盐缓冲液，pH6．9，其中加有ALA(即δ-Amino-Levulinic Acid，CH₂NH₂·CO·CH₂·CH₂·COOH，氨基乙酰丙酸)达2mM、硫酸镁达0．08mM，每一试验用0．5ml，盛于100mm×10mm小试管中］，置37℃水浴中4h，取出，在暗室内以波长为360nm的紫外光灯(检查皮霉菌的Wood Lamp就可用)照射，菌体悬液如出现红色荧光，反应+，说明细菌能从ALA→卟啉，因为卟啉遇紫外光现红色荧光，而卟啉是血红素中起X因子作用的关键结构，能合成卟啉，反应阳性，说明不需要X因子。反之，就需要X因子。此法比测定需要不需要X因子的其他方法要精确，例如纸片法的误差可达20%。试验时可接种确知需要X因子和不需要X因子的细菌作为对照。

如不以紫外光照射，可将置37℃下4h的小试管，加入0．5ml Kovacs试剂，用力摇振之后，如底层水相现红色，为阳性反应，说明已形成卟啉，此菌不需X因子。但必须以不含ALA的试液作对照，因为万一有吲哚存在(紫外光照射不现红色荧光)也会出现红色的假阳性反应，不过红色是出现在上层的酒精相。

嗜血杆菌属的生化反应操作如下。

糖发酵试验在培养基中要加入X因子(结晶血红素1μg／1ml)及过滤灭菌的V因子(NAD1μg／1ml)。

其他生化反应都尽量避免将细菌接种到生化培养基培养看细菌生长后的反应，而是将细菌生长在固体培养基上，像ALA→卟啉试验那样，每一试验都是用小试管盛0．5ml试液，加入一浓厚接种环的细菌使成细菌浓悬液，置37℃4h，观察结果。

1．靛基质试验 试液为含0．1%左旋色氨酸的pH6．8的M／15的磷酸盐缓冲液，37℃4h后取出，加0．5mlKovacs试剂，振摇后，上面酒精相出现红色者为阳性。

2．尿素酶试验 试液为1000ml蒸馏水中含KH₂PO₄0．1g、K₂HPO₄0．1g、NaCl0．5g、1／500酚红(0．2g酚红溶于92ml蒸馏水，加入1N的NaOH8ml)0．5ml，以5N的NaOH调pH(用1N的NaOH调，嫌加入液体的量多)至7．0，15磅高压15min，冷后，无菌操作加入过滤灭菌的20%尿素水溶液10．4ml即成。加细菌后置37℃4h内现红色者为阳性反应。

3．鸟氨酸脱羧酶及精氨酸双水解酶试验 试液用Moller氏培养基，37℃下4h内现紫红色者为阳性反应。

表13-6 嗜直杆菌属各个种的不同特性

符号：+．90%或更多的菌株为阳性 d．11～89%的菌株为阳性 -．10%或较少阳性反应 w．弱阳性反应。的菌株为阳性 ［d］11～89%出现迟缓阳性反应 ［+］、90%或更多的菌株出现迟缓。

4．半乳糖苷酶试验(即ONPG试验) 见第六章第一节。

5．岩藻糖苷酶试验 同上述ONPG试验，仅以对位硝基苯-α-左旋吡喃岩藻糖苷(P-nitrophenyl-α-L-fucopyranoside)代替ONPG。

6．CAMP试验 系溶血试验，见十章二节。培养基是含绵羊血5%的平板，以被检嗜血杆菌代替被检链球菌。靠近金色葡萄球菌的嗜血杆菌，能表现出较强溶血性(原无溶血表现有溶血，或嗜血杆菌的原溶血区小表现得较大)者为阳性。CAMP是四个人名字的头一个字母。

胨3号琼脂(Difco proteose No．3 agar)的做法如下。

将胨(proteose peptone No．3 Difco)20g，葡萄糖0．5g，氯化钠5g，磷酸氢二钠5g，琼脂15g，加热溶于1000ml水中，调pH至7．4，高压(15磅15min)灭菌，备用，供测定嗜血杆菌对X或V因子的需要用。高压后就用此培养基，可在近100℃时加入X因子(血红素)。而V因子(NAD)则不耐热，只能在45℃时加入，立即混和并倾注平板应用。

在没有胨时，可用胰胨(tryptone)替代。