致病性霉形体检验
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第467页（7550字）
霉形体目(Mycoplasmatales)区分为霉形体科(Mycoplasmataceae)，无胆甾原体科(Acholaplasmataceae)和螺旋原体科(Spiroplasmataceae)。霉形体科和螺旋原体科生长需要固醇而无胆甾原体科则否，螺旋原体科依其生长的某一时期呈现螺旋状的表型特征区别于霉形体科。
根据不能水解尿素、能水解尿素，再将霉形体科区分为霉形体属(Mycoplasma)和脲原体属(Ureaplasma)。无胆甾原体科和螺原体科均仅一属。
一、猪源霉形体的检验
(一)猪肺炎霉形体(Mycoplasma hyopneumoniae)是猪霉形体肺炎(又称猪喘气病)的病原体。
1．病料采集和处理 用无菌手续采集肺脏实变与正常区交界处的组织，如肺脏表面已污染，则取较大的实变组织，投入沸水中8～10s，然后无菌切取检样。采集的组织应包括支气管。在非选择培养基中(不含抗猪鼻霉形体血清)，将组织磨碎，制成10%悬液。用含有1～2ml选择培养基(含抗猪鼻霉形体血清)和非选择培养基的试管，分别作10-1至10-5稀释。也可用棉拭收集气管或支气管分泌物或呼吸道洗液，如上法稀释。
2．分离培养和鉴定
(1)将含有稀释病料的液体培养基置于37℃中培养，每天观察pH变化，再将产酸的培养物移植于新鲜液体培养基中，如此多次移植，直至培养1～2天时培养基的pH降至约6．8，表明已适应生长为止。
(2)用抗猪肺炎霉形体、抗絮状霉形体(Mycoplasma flocculare)和抗猪鼻霉形体的高免血清对产酸培养物进行代谢抑制试验，抑制微生物产酸效价最高的抗血清其抗原与该微生物同种。如结果不明确，表示培养物混杂有别种霉形体，可在选择培养基上移植几次后再试。也可在A26琼脂平皿上用单菌落移植法纯化鉴定。
(3)在A26琼脂平皿上加0．1ml待纯化的肉汤培养物，使流淌均匀，吸干多余的液体，置于含5～10%CO2的潮湿大气中，在37℃中培养。猪肺炎霉形体的菌落于培养2～3天时直径约25μm，培养10天时可达100μm，菌落形态不呈“煎荷包蛋”状；猪鼻霉形体菌落生长迅速，呈典型“煎荷包蛋”状。
(4)必要时经单菌落移植，用生长抑制试验进行鉴定。
如样品中存在猪鼻霉形体，初次分离时在非选择培养基中几天就能生长，移植后则24h内即生长。而猪肺炎霉形体生长较慢’初次分离时培养3～28天才产酸，移植后24h内不生长，但经移植3～10代适应后于24～48h生长。选择培养基中的高稀释度常能获得猪肺炎霉形体的纯培养。
猪肺炎霉形体(以及以下各种霉形体)的生理生化特性见表19-3。菌体经姬姆萨染色呈纤细的两极状、车轮状和戒指状等极度多形态(图19-1)，絮状霉形体的菌体菌落形态和生理生化特性与猪肺炎霉形体相同，二者需用血清学方法加以鉴别。
用下述方法可以从新鲜的病肺组织中检出猪肺炎霉形体。
(1)病肺触片用姬姆萨染色法，所见形态与肉汤培养基中相同
(2)冰冻切片免疫荧光染色法查呼吸道上皮细胞。
(二)猪鼻霉形体(Mycoplasma hyorhinis) 通常寄生于猪呼吸道。是多发性浆膜炎——关节炎的病原体，严重病例多见于10周龄猪，某些菌株使胸膜、腹膜、心包膜及滑膜等所有浆膜产生病变。另一些菌株仅感染心包膜或关节面。猪鼻霉形体是猪霉形体性肺炎病料中常见的分离物，但其在自然发生的肺炎中的致病意义尚未阐明。
1．病料采集
(1)取鼻腔和下呼吸道分泌物；
(2)采集肺组织制备匀浆(用非选择培养基作稀释。按分离猪肺炎霉形体的方法)；
(3)取浆膜或关节渗出液。
2．分离培养和鉴定
(1)置液体培养物于37℃中1～3天，每天检查培养管上部的轻度乳白色和底部沉淀或培养基产酸。丢弃因细菌污染而严重浑浊的试管；
(2)将已生长的培养物移植到固体培养基，置37℃含5～10%CO2的大气中培养，同时再移种1支液体培养基；
(3)培养2～4天，在低倍显微镜下检查菌落，菌落特征一致时，以所移的液体培养物用代谢抑制试验进行鉴定。平皿上菌落用表面免疫荧光法鉴定；
(4)肉汤培养物涂片经姬姆萨染色必需为细小球状、豆点状微生物(图19-2)。
(三)猪滑液霉形体(Mycoplasma hyosynoviae) 是猪霉形体关节炎的病原体，通常发生于体重30kg以上大猪，最常感染后膝关节，不伴有多发性浆膜炎。
1．病料采集和处理
(1)从打开的关节取关节液；
(2)用棉拭取鼻腔分泌物或擦扁桃体表面取喉分泌物；
(3)扁桃体、淋巴结、肺或其他组织用粘液素牛心汤制成悬液再作稀释。
2．分离培养和鉴定
(1)将液体培养物置于37℃培养3天，每天观察1次，直至颗粒状生长物在肉汤中扩散，产生颗粒状沉淀，pH升至7．4；
(2)及时移种，以免微生物死亡；
(3)接种粘液素——牛心汤琼脂，置于含5～10%CO2的潮湿大气中培养2～4天；
(4)生长成直径0．05～1mm“煎荷包蛋”状菌落；
(5)用表面免疫荧光、生长或代谢抑制试验进行血清学鉴定。
3．主要生长特征生长于含有禽或马血清的琼脂培养基中产生膜和点；在液体培养基表面形成薄膜；液体培养物沉淀经姬姆萨染色镜检，可见由典型的球状蓝紫色霉形体细胞围绕着直径约5μm的非结晶性球状结构。
二、牛源霉形体的检验
1．种 迄今从牛体已分离出22种霉形体，在病原学或污染细胞培养有重要意义的种如下。
(1)丝状霉形体(Mycoplasina mycoides) 牛传染性胸膜肺炎的病原体，多数菌株能形成长度差异很大的有分枝的丝状体，菌落呈“煎荷包蛋”状。
(2)殊异霉形体(Mycoplasma dispar) 通常存在于呼吸道，与小牛肺炎有关，偶尔也从犊牛外观正常的上、下呼吸道分离到。菌落呈颗粒状、花边状或网状，不呈现“煎荷包蛋”样；在低代次移植中，培养1～3天，菌落直径可达1．5mm，而继续在培养基上通过数代后，菌落变小。
(3)牛霉形体(Mycoplasma bovis) 通常存在于呼吸道和生殖道，是牛乳房炎的病原体之一，乳腺接种可诱发乳房炎，用培养物或经培养物污染的精液接种于小母牛子宫，可诱发子宫内膜炎和输卵管炎，自然感染和实验诱发的乳房炎均可并发败血性关节炎。菌体呈非常短的细丝状。
(4)牛生殖道霉形体(Mycoplasma bovigenitalium) 常见于公、母牛下生殖道，与颗粒性阴道炎等有关，不一定影响生殖，也是牛乳房炎的病原体之一。菌体呈短的细丝状。
(5)精氨酸霉形体(Mycoplasma arginini) 通常存在于呼吸道和生殖道，致病性尚未阐明。是最常见的污染细胞培养的霉形体，由牛血清中带入，菌体形态描述不详。
(6)溶脲脲原体(Ureaplasma urealyticum) 从结膜、肺、尿道、阴道、膀胱、包皮、精液中分离到，可能与犊牛肺炎和角膜炎、结膜炎有关。
2．病料的采集和处理
(1)生殖道灌洗液、牛奶、关节液等，用葡萄糖肉汤、精氨酸肉汤、尿素肉汤作40至80倍稀释。
(2)肺组织等，用无菌法从深部切取约1cm3的组织磨碎，用Hank氏液使成20%悬液。取上层悬液如液体样品法稀释。
3．培养和观察
(1)将稀释样品加橡皮塞或旋紧螺盖，置于37℃中培养。每天检查培养物并记录pH变化情况。
(2)变色的培养物用培养基作10-1至10-5稀释，将其中10-a至10-5稀释度分别接种至葡萄糖血清和尿素琼脂平皿上，每皿接种0．1ml，使分布均匀，置于含5%CO2和95%N2的37℃中培养，稀释好的液体培养基应同时进行培养。
(3)三天后检查平皿，有菌落生长时即用免疫荧光法鉴定。如无菌落生长，则检查同时培养的稀释液体培养物，察看初次分离时产生的色变是否确由霉形体引起。
(4)可为种的鉴定提示方向的因素
①液体培养基pH变化的方向(酸或碱)、程度(强或弱)及开始出现的时间。表19-4摘录了牛源霉形体初分离时的培养特征及其所提示的种。
表19-4 各种牛源霉形体初分离的某些特性*
*参考洋地黄皂苷敏感性试验排除无胆甾原体科以后进行。
②分离部位，如殊异霉形体仅从呼吸道分得。
③培养期长短，如牛鼻霉形体在葡萄糖肉汤中通常在3天时高稀释度亦可生长；而殊异霉形体通常在3天时才开始出现色变。牛生殖道霉形体生长更慢且产酸轻微，只能在培养7天和14天时盲目移植至固体培养基上。
三、山羊和绵羊霉形体的检验
1．致病性霉形体的种
(1)无乳霉形体(Mycoplasma agalactiae) 从乳腺、淋巴结、关节中分离到，是绵羊和山羊传染性无乳症的病原体。用皮下接种诱致实验感染时山羊比绵羊更敏感，炎症局限于雌性的乳房，但有10～20%的病例是在关节。实验接种也能诱致阴道炎，菌体呈短到中等长度的细丝，菌落呈煎荷包蛋状。
(2)山羊柱状霉形体(Mycoplasma capricolum) 可从患关节炎的关节中分离到，与败血症、多发性关节炎和某些老山羊的结膜炎有关。研究资料表明，可诱致与丝状霉形体所致的几乎相同的疾病，死亡率可高达90%，菌落呈煎荷包蛋状。
(3)山羊霉形体(Mycoplasma capri) 从肺、脾和肝分离到，是山羊传染性胸膜肺炎的病原体，也可致水肿和蜂窝织炎以及公山羊的败血症和急性多发性关节炎。丝状体的长度约10～13μm，在液体培养基中产生强的乳光。培养3天后菌落直径可达1．5～4mm。
(4)羊肺炎霉形体(Mycoplasma ovipneumoniae) 从鼻、气管、支气管、肺和眼内分离到，是绵羊增生性间质性肺炎的病原体，菌落呈颗粒状，无中央乳头。
2．病料的采集
(1)从活畜的鼻腔、口腔、外耳、呼吸道和直肠采集病料，从肿胀的关节吸取滑液；
(2)从尸体采集病料时，采上述样品外，还应采取病肺组织。
3．分离培养
(1)样品接种琼脂平皿，再接种液体培养基。但固体培养基置于5～10%CO2的37℃培养箱中。
(2)3日后在低倍镜下检查，琼脂平皿上的菌落，直至生长良好为止。
(3)液体培养基发生pH变化时，同时移到液体和固体培养基。上述各培养物到7天仍无生长可废弃。
(4)从平皿上挑出代表不同种的菌落，分别接种至液体培养基中，置于37℃培养。
(5)生长的液体培养物经孔径450或300nm的微孔滤膜过滤，然后接种固体培养基，再作单菌落移植。
(6)经纯化的液体培养物贮藏于零下30℃中。
4．生化鉴定 已知绵羊和山羊有21种霉形体，分离物先经生化试验初筛，可减少鉴定种所需的抗血清种类。试验步骤及其提示的线索如下
(1)洋地黄皂苷敏感性试验，不敏感属无胆甾原体。
(2)敏感株做葡萄糖和精氨酸代谢试验。两者均阴性属无乳霉形体，两者均阳性属发酵霉形体。葡萄糖阴性精氨酸阳性属精氨酸霉形体。
(3)对葡萄糖阳性、精氨酸阴性株测酪蛋白消化活性，酪蛋白消化阴性属羊肺炎霉形体。酪蛋白消化阳性属山羊霉形体、丝状霉形体。
5．血清学鉴定 参考分离物的菌落形态，生化特征、宿主和分离部位而选用抗血清。通常用生长抑制试验能获得满意的结果，也曾发现模式株的抗血清对羊肺炎霉形体、无乳霉形体和精氨酸霉形体生长抑制的强度因菌株而异，以及种和亚种间有某些交叉反应。因此，必要时用免疫荧光法确定种。
四、鸡源霉形体的检验
1．致病性霉形体
(1)鸡败毒霉形体(Mycoplasma gallisepticum)为鸡慢性呼吸道的主要病原，也可引起火鸡传染性窦炎或脑炎。
(2)滑液霉形体(Mycoplasma synoviae)致小鸡和火鸡传染性滑膜炎和气囊炎，病的慢性期出现心包炎和心肌炎。
(3)火鸡霉形体(Mycoplasma meleagrides)为火鸡气囊炎病原。
2．病料系集 用棉拭从活鸡的口咽、食道、气管、泄殖腔中取样，每一部位2支。从死鸡取样除上述样品外，再擦拭气管、关节；用液体培养基灌洗输卵管、眶下窦，收集洗液；剪取气管、肺和气囊组织。
3．分离培养
(1)先将棉拭涂布琼脂平皿，然后接种含葡萄糖的液体培养基。将另一支棉拭接种含精氨酸液体培养基。
(2)将0．1ml洗液样品接种琼脂平皿，使其流淌均匀。再接种含葡萄糖和精氨酸的液体培养基各一管。
(3)将固体样品充分剪碎，加入含葡萄糖液体培养基静置片刻，吸上层悬液接种固、液体培养基。
(4)琼脂平皿置于5～10%CO2的培养箱中，液体培养物需加橡皮塞同时置于37℃中培养。
(5)每天观察液体培养物颜色变化，培养24h以内pH降至6．8者，多数情况系标本中活细胞代谢所致，应以20%接种量，移植到含葡萄糖和精氨酸的液体培养基各一管及固体一皿。无pH变化的液体培养物，每5～7天盲传1次，共3次。
含葡萄糖的培养基pH降至7．0～6．8，含精氨酸的培养基pH升至7．4～7．6时，进行移种。
4．鉴定
(1)据液体培养基pH变化以确定生长物代谢何种基质。
(2)生化试验。以膜点试验和四氮唑还原试验初步区分霉形体种。
(3)血清学试验可根据上述二项结果，参照有关霉形体的生化特性，选用抗血清进行生长抑制或代谢抑制试验，或用免疫荧光试验作出种的鉴定。