干扰素测定方法
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第575页（5222字）
干扰素是具有高度生物活性的细胞产物，能促使细胞产生抗病毒蛋白。下面介绍几种常用的测定方法。
一、细胞病变抑制法
此法操作简便，结果可靠，为许多实验室普遍使用。缺点是不能完全排除判断结果中的主观因素。
(一)试验材料
1．待测干扰素制剂 待测制剂中常含有非干扰素病毒抑制物，因此需要预处理：(1)超速离心处理：100000×g1h；(2)酸处理：先以6mol／LHCl将标本调至pH2，若为γ干扰素，则调至pH3．5，置4℃48～72h，再以6mol／LNaOH调至pH7．2～7．4；(3)热处理：α和β干扰素一般在60℃1h不被灭活，而γ干扰素被灭活。
2．测定细胞 一般应选用同种动物的细胞。如；测定鸡干扰素可用鸡胚细胞，测定猪干扰素可用猪肾细胞。
3．攻击病毒 一般用水泡性口膜炎病毒(VSV)或Sindbis病毒。使用前应在细胞培养中传代增殖，并滴定其TCID50。病毒攻击量一般为100～300TCID50。
(二)操作步骤
1．制备单层细胞培养 测定前一天制备原代细胞或传代细胞，培养24h后长成单层即可使用。
2．用干扰素处理细胞培养 将待测干扰素以含2～5%小牛血清的维持液作2倍递增稀释。轻轻倒去细胞培养液，每瓶加入干扰素稀释液0．5ml。对照组只加维持液。将细胞培养置于37℃培养18～24h。
3．加病毒攻击 用维持液将病毒稀释至100～300TCID50／ml。倾去细胞维持液，每瓶加入1ml病毒稀释液。病毒对照组也接种病毒液，而细胞对照组只换新维持液。37℃继续培养24～48h，取出观察。
(三)结果判定
1．判定标准 在规定时间内(24～72h)，首先观察对照组。若病毒对照组各瓶中细胞出现75～100%CPE，而细胞对照组的细胞仍生长良好，即可全面观察。细胞病变保护程度划分为4等，即以“4”表示无明显CPE，“3”表示CPE占25%左右，“2”表示CPE占50%左右，“1”表示CPE占75%左右，“0”表示CPE占100%。
2．判定与计算 干扰素的抗病毒活性以单位／ml表示，有一般判定法和Reed-Muench法。前者国际上最常用。方法是：能保护半数细胞(50%)免受“攻击病毒”损害的1ml干扰素制剂的最高稀释度的倒数即为干扰素的单位／ml。例如，1ml某干扰素被稀释到1∶10000时仍能保护50%的细胞，则干扰素的滴度为10000单位／ml。Reed-Muench法与病毒中和试验中血清中和效价的计算相同。
此法也可在微量细胞培养板上进行。优点是需要的细胞用量少，适于大批干扰素制剂的检测。
二、中性红摄入测定法
活细胞可摄入一定浓度的中性红，并使其着色，而死亡的细胞却不能。两种细胞在分光光度计中的吸光率不同，可借以判定细胞培养的损害程度。此法的优点是结果判定客观、精确和简单，便于大量标本检测。
(一)试验材料
1．中性红原液 配法：(1)2g中性红于乳钵中磨细；(2)加入40ml酒精，调匀使其溶解；(3)加入蒸馏水至200ml；(4)用滤纸过滤；(5)0．5×105Pa高压蒸气灭菌20min，放4℃冰箱保存。
2．脱色液 0．1mol／L NaH2PO4溶液和95%的酒精等量混合(pH4．5)。
3．其余同“细胞病变抑制法”。
(二)操作步骤
1．同“细胞病变抑制法”中的1～3。
2．染色前，倾去病毒液，用生理盐水将细胞单层洗一次。
3．以生理盐水将中性红原液稀释至1∶20000，调至pH7．2～7．4，每瓶加1ml。
4．置37℃1h，将中性红染液弃去。
5．每瓶用生理盐水洗3次。
6．加入脱色液，每瓶2ml，室温放置5～10min。
7．将同一干扰素稀释度的细胞瓶中的脱色液混合，用1～2%NaOH或70℃20min灭活病毒。
8．用分光光度计测定混合液的OD540值，记录读数。
(三)结果计算 有Reed-Muench法和回归直线法两种，前者基本同于中和试验。
1．将干扰素各稀释度之OD值除以正常细胞之OD值，然后乘以100%。
2．将各百分数化为机率单位(Y)。
3．求出回归系数(b)。
4．代入如下公式
公式中 Y——机率单位
——机率单位均数
——干扰素稀释度对数的均数
X——1gED50(半数有效量)
最后查出1gED50的真数即为该干扰素的单位／ml。例如：1gED50=2。295，由反对数表查得真数是200，该干扰素的效价为200单位／ml。
三、空斑形成抑制法
此法较灵敏、精确，结果计算比较客观，但操作较繁，细胞用量多。
(一)试验材料
1．营养琼脂 细胞培养液中含1-2%琼脂，青霉素100单位／ml，链霉素100μg／ml，5%小牛血清，4%1∶1000中性红，3～4%NaHCO3。
2．其余同“细胞病变抑制法”。
(二)操作步骤
1．弃去细胞单层的营养液。
2．每瓶加入2倍递增稀释的干扰素0．5～1．0ml，37℃孵育24h。对照瓶不加干扰素。
3．吸去干扰素液，以Hanks液洗1次，加入50～100PFU攻击病毒，37℃吸附1～2h。
4．弃去病毒液，用Hanks液洗1次。加入含中性红的营养琼脂，37℃继续孵育一定时间后计算空斑数。
(三)结果计算 按中和试验法进行。
四、病毒繁殖抑制法
此法敏感性较高，但操作繁琐，不宜用于大量标本的检测。
(一)试验材料 同“细胞病变抑制法”和“空斑形成抑制法”。
(二)操作步骤
1．同“细胞病变抑制法”中的1～3。
2．收集细胞培养液。
3．用空斑法或细胞病变法测定每组的病毒含量。
(三)结果计算 与对照组比较，以抑制病毒繁殖量50%的干扰素最高稀释度作为其滴度。
病毒的繁殖量也可用血凝或血吸附试验测定。
五、放射化学测定法
用抑制3H尿嘧啶核苷掺入病毒RNA的程度来表示干扰素的抗病毒活性。
(一)试验材料3H尿嘧啶核苷，放线菌素D，三氯醋酸，其余同“细胞病变抑制法”。
(二)操作步骤
1．同“细胞病变抑制法”中的1～2。
2．倾去干扰素液，以Hanks液洗一次。
3．每瓶加入10～25PFU／细胞的攻击病毒，37℃放置30min。
4．每瓶加入5μg放线菌素D，2～3h后换以含3H尿嘧啶核苷的培养液(0．4～1．0μCi／瓶)，37℃放置4～5h。
5．倾去培养液，把细胞刮入冰浴中的缓冲盐水中。
6．加入冰冷的5%三氯醋酸，沉淀出酸不溶性物质。
7．将上述液体倾在玻璃纤维滤纸上，沉淀被集中在滤纸上，用三氯醋酸和乙醇洗数次。
8．将滤纸放入液体闪烁计数器中测定其放射性强度。
(三)结果计算 能抑制50%3H尿嘧啶核苷掺入病毒的干扰素量为1个单位。
表24-1将上述方法的某些特性作一比较，以便读者选择时参考。
表24一1 几种测定干扰素方法的比较
* 4示最好；3示较好；2示较差；1示差。
六、干扰素单位的标准化
干扰素测定受多种因素影响，不同实验室所测得的效价差异往往很大，难以比较。为此，1969年通过国际会议制定了干扰素参考单位，藉此，可以把干扰素单位统一起来。常用的国际标化干扰素可以从美国国立医学研究院(NIMR)或卫生研究院(NIH)索取。
标化干扰素单位的步骤：
(一)测出本实验室的参考制剂的效价与国际标准制剂效价的比值。
(二)未知制剂与本实验室的参考制剂同时滴定，从而算出国际单位。
作为标准的参考干扰素制剂应分装于小安瓿内，冻干保存。
七、影响干扰素活性测定的因素
在干扰素的测定系统中，有三方面的影响因素，即干扰素制剂、攻击病毒和细胞培养。
(一)干扰素制剂 在干扰素制剂中常混有各种污染物质，影响干扰素的测定结果(表24-2)。
表24-2 可能混杂在干扰素制剂中影响其测定结果的因素
(二)攻击病毒 不同的病毒株、攻击量及攻击后读取结果的时间对测定结果都有影响。
(三)细胞培养 不同的细胞系或株、细胞的日龄、细胞的数量、细胞的代谢条件及培养温度等都会影响干扰素的测定。双倍体细胞株对干扰素最敏感，原代细胞次之，传代细胞系最不敏感。日龄较大的鸡胚制备的细胞比日龄较小者敏感。在35～39℃中进行测定结果无差异，4℃时干扰素不能发生抗病毒作用。