鸡新城疫微量血凝抑制(HI)试验操作技术

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《动物检疫手册》第139页（2185字）

(一)材料准备

1．浓缩抗原：以含有Las0ta系病毒的尿囊液经福尔马林灭活，聚乙二醇浓缩制成，其血凝价为5000－10000。用聚乙烯塑料管小剂量分装，置4℃冰箱中保存备用(可在4℃下保存10个月以上，效价不变)。每次作血凝抑制试验时按固定比例稀释配制4个血凝单位浓度的抗原()。此抗原华中农业大学牧医系微生物组有生产可供应。

2．红细胞悬液：采成年鸡血于加有等量A1sever液的试管中，充分混合，用PBS(pH7．0－7．2，0．01M)或生理盐水洗涤血细胞，每次以3000转／分离心5－10分钟，重复3－4次，最后一次离心10分钟。吸取压积血细胞，用PBS或生理盐水配成0．5%悬液。或先配成10%浓悬液(4℃下可保存3－4天)，用时进行20倍稀释。

3．标准阳性血清：采自高度免疫的成年鸡，经效价测定后分装小瓶，标明HI价。低温冰箱保存备用。华中农业大学牧医系微生物组有生产可供应。

4．待检血清：监测鸡群免疫水平时，每群随机采血20－30份血样。先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6－8厘米长，在酒精灯火焰上将管一端烧熔封口，用胶布标明鸡号或群号，置37℃温箱中2小时，待凝固析出血清后以2000转／分离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中。如需较长时间保存，可在离心后，将凝血块一端剪去，封口冻存于冰箱内。

5．Alsever液：葡萄糖2．45克，枸橼酸0．8克，枸橼酸钠2．2克，溶于100毫升蒸馏水中，10磅高压灭菌20分钟。

6．器材：96孔V型凝集板、针管定量稀释器、微型振荡器、塑料采血管、微量吸液器等。

(二)操作方法

1．微量血凝(HA)试验。见表2－13。

表2－13 微量血凝(HA)试验

(1)每孔滴加生理盐水或PBS0．05毫升，共滴四排孔。

(2)以针管定量稀释器吸取1∶5稀释抗原0．05毫升于第1列孔，挤压4－6次混匀后，吸出0．05毫升至第2列孔，依次倍比稀释至倒数第2列孔，混匀后弃去0．05毫升，最后一列孔不加抗原作为对照。

(3)换去滴头吸0．5%红细胞悬液依次加入各孔，每孔0．05毫升。

(4)振荡1分钟，混匀。

(5)置室温下(18－20℃)30－40分钟。根据红细胞凝集图来判定结果，以4排孔出现完全凝集的抗原最大稀释度的几何均值作为该抗原的血凝滴度，即一个血凝单位。

(6)然后分别将抗原稀释成含8个和4个血凝单位的抗原稀释液，以备HI试验用。

2．微量血凝抑制(HI)试验见表2－14。

表2－14 微量血凝抑制(HI)

(1)吸取生理盐水或PBS0．05毫升，加入第1孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3－12孔中，每孔为0．05毫升，第2孔加浓度为8个血凝单位的抗原0．05毫升。

(2)吸待检血清于第1孔中(血清对照)，混匀后吸取0．05毫升于第2孔，依次倍比稀释至第12孔，最后一孔弃去0．05毫升。

(3)置室温(18－20℃)下作用20分钟。

(4)滴加0．5%红细胞悬液于各孔中每孔0．05毫升，振荡混合后，室温下静置30－40分钟，判定结果。

(三)结果判定 以完全抑制血细胞凝集的血清最大稀释度为该血清的血凝抑制(HI)滴度。如以2为底的对数(Log2)表示，其HI滴度恰与板上出现完全抑制的最高孔数一致(为精确比较不同样品的HI滴度，可将最高抑制孔后一孔的不全抑制状态，25%、50%、75%的抑制分别以对数0．25、0．5、0．75表示，作为前面整数的尾数)。

据报道，鸡群的HJ抗体水平以抽检样品的HI抗体几何均值表示，如平均水平在41og2以上，表示该鸡群为免疫鸡群。

当鸡群受到野外强毒侵袭时，总有一些个体能耐过感染而存活。同时产生极高的抗体水平。用此法在鸡群中检测时，如有较多111og2以上的高抗体鸡出现，说明鸡群已受到新城疫强毒的感染。