酶水解-三氯化铁-冰醋酸法测色氨酸

出处：按学科分类—农业科学 农业出版社《土壤农化分析手册》第583页（1646字）

(一)适用范围 本法常用于谷物和饲料中的色氨酸测定，方法简单、快速，尤适于谷物高色氨酸筛选工作之用。方法是鉴于玉米谷物中的蛋白质经木瓜蛋白酶水解后，色氨酸解离出来。在浓硫酸存在时，三价铁离子将醋酸氧化为乙醛酸(CHO·COOH)。色氨酸中的吲哚基与乙醛酸缩合成红紫色化合物，颜色深浅与色氨酸含量成正比。

(二)试剂配制

1．正己烷或乙醚或石油醚(三级)。

2．0．1N醋酸钠缓冲液(pH7．0) 称取13．608g结晶醋酸钠，放入1L容量瓶中，用蒸馏水溶解后，定容至刻度。

3．木瓜蛋白酶溶液 按4mg木瓜酶，溶于1ml的0．1N醋酸钠缓冲液中的比例配制过滤后使用(现用现配)。

4．混合显色剂 (1)快速称取270mg三氯化铁(FeCl₃·6H₂O)，溶于0．5ml蒸馏水中，用冰醋酸稀释至1L。(2)30N硫酸(833．3ml浓硫酸溶于167ml水中，使最终体积为1L)。使用前将等体积(2)徐徐倒入(1)，等量混合即成。

5．色氨酸标准贮备液 将色氨酸于105℃烘箱中烘2h，取出放入干燥器中，冷却至室温。称取25．0mg，放入250ml容量瓶中，加少许蒸馏水，以热水浴加热使其溶解。冷却，定容。此为100ppm色氨酸标准贮备液。

(三)测定步骤 称取磨细通过0．5mm孔径的样品0．100g于10ml离心管中(油料作物种子应用正己烷或乙醚连续浸提样品滤纸包6－8h，使脱脂)，加4．00ml木瓜蛋白酶液，加塞振荡3min，使样品充分湿润，但勿使沾附管壁。置65℃保温箱中酶解过夜。次日取出酶解液，振荡1min，冷却至室温。然后以每分钟3000转离心15min。

吸取上部清液1ml于10ml比色管中，加4．00ml混合显色剂，摇匀，置65℃保温箱中15min，取出冷却，在545nm波长处进行比色，读取吸光度。从工作曲线上查得色氨酸ppm数。同时作空白试验，用0．1ml水代替样品，放在10m1离心管中加木瓜酶液4．00ml，以下按样品测定步骤同样进行酶解及显色。样品色氨酸ppm数减去空白试验的ppm数，再计算色氨酸%。

工作曲线绘制：用10ml微量滴定管，装100ppm色氨酸标准液，准确向8个10ml容量瓶中分别加入1．0，1．5，2．0，3．0，4．0，5．0，6．0，7．0ml，用pH7．0醋酸钠缓冲液稀释至刻度。此浓度分别为10，15，20，30，40，50，60，70ppm各吸取1ml于10ml试管中。另吸取1mlpH7．0的醋酸缓冲液(作空白)于10ml试管中。各加4．00ml混合显色剂，摇匀。以下按样品测定步骤进行显色。以吸光度为纵坐标，系列色氨酸浓度(10－70ppm)为横座标，绘制工作曲线。

(四)结果计算

式中：色氨酸ppm——由工作曲线上查得样品的ppm数减去空白试验的ppm；

10^-4——由ppm换算成%。

(五)注释

①本法要求65℃保温显色，必须严格控制温度和时间，否则结果不一致。

②色氨酸标准液，须现配现用，常温下保存最多不超过叁天，以免生长霉菌，影响测定结果。