甘薯
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第402页（13400字）
甘薯(Ipomoea batatas)属旋花科。未知有其野生状态。起源于热带美洲。Pigafetta在1519年访问巴西时发现印地安人用甘薯为粮食，首次提到甘薯的根。热带美洲的二种古代文化：Mayan和Peruvian生长和栽培甘薯。南太平洋岛屿的远古栽培，提出自古以甘薯为粮食，存在于世界的二个不同地区。
甘薯适应广大气候范围和土壤类型。正常生长于40°N-32°S，海拔9000英尺。主要生产区域是平均温度23．8℃或较高，年平均降雨量30-50mm时，充足阳光，无霜期4-6个月。
甘薯根和叶可用食料和饲料。异种间或异属间杂交的障碍是有性不亲和性。应设法克服，以扩大其遗传基础。组织培养和体细胞杂交对此提供着巨大希望。AIconero等(1975)用分生组织培养，在短时间内产生无病毒植株。其它需要改进性状如：营养质量和成分，加工品质，表征，烹饪性质，叶(绿)品质和工业用品种如Gasohol，以及动物饲料。
组织培养在甘薯育种应用潜力很大，可用于产生无病毒植株，可在相对小面积内保存、大群体的遗传纯材料。至今，由于繁殖的营养性质，必须每年更新种质。采用组织培养能节省储藏和苗圃中的大量费用。为消费者提供价廉产品。
(一)研究进展
日本Yamaguchi及其同事们在1960年代最早人工培养甘薯。加拿大Velicky，Zink，Rose等发表了关于月见草(Ipomoea purpurea)的大量论文。
1．愈伤组织的形成和生长 甘薯大多数愈伤组织培养的外植体材料是茎或根。人工组织培养中的愈伤组织，能继续无限生长。尽管启动组织的同质性，和供试外植体在规定培养基上建立和保持真正同质性质的意图，能和的确发生很多变异，尤其是继后继代中是如此。这可能由于种或栽培品种的真实全能性，就是组织有脱离其原来同质性质趋向，由于它含有亲本植株的全部固有生化潜势。所以，人工培养生长的愈伤组织可能具有诸细胞的“混合群体”。为了避免这些情况，和试图建立真正同质性细胞群体，游离单细胞可能是唯一解决方法，即使如此，在长期培养和培养基成分不同，可能它们原有性质发生改变。
曾用White，Gamborg，MS培养诱导愈伤组织形成，其中以MS或改进的MS最好。Yamaguchi与Nakajima(1972)采用改进的White培养基产生愈伤组织、不定根和芽。他们认为甘薯同品种的各个块根间的根没遗传上全能性差别。用无菌软木钻孔器和刀片，把块根切成直径4mm高3mm的薄片，接种在直径3cm高10cm玻璃器皿内的20ml琼脂上，暗培，30℃。培养基是White盐类，5g／LDifco酵母浸出液，146mM蔗糖，pH5．8-6．0。愈伤组织培养在含5．4μMNAA培养基上，6周后产生不定芽，供体外植体取自曾贮存6个月的块根。为了从新收获块根诱发不定根，培养基中要加细胞分裂素(KIN和ZEA)0．5-50．0μM。当细胞分裂素抑制了不定芽形成，有些品种可用脱落酸(ABA)和低浓度2，4-D配合，促进之。结论是细胞分裂素对器官形成有重要作用，ABA对甘薯组织内生细胞分裂素有颉抗效果。不定芽产生再生植株。
Hill(1965)采用White基础培养基附加：2，4-D，IAA，n(2，4-D)邻氨基苯甲酸，n(苯氧乙酸)邻氨基苯甲酸和GA浓度范围0．01-1．0mg／L。外植体以根端和茎端命名，有些以正常(极)位和其它以倒位放入试管中。结论甘薯根固有的极性，可因生长物质而改变，尤其是2，4-D和IAA。前者使茎端产生愈伤组织，后者(IAA)在根端形成愈伤组织。这些生长物质也对木质部分化和细胞活性有影响。
Gunckel等(1972)研究极性影响和White培养基上的许多有机附加物：IAA，NAA，2，4-D，硫酸腺素，KIN，GA和椰乳对三种栽培品种(Yellow Jersey，Jersege Orange和Centennial)根、芽启动与这种外植体愈伤组织产生的关系。培养物放在500呎烛光，25℃，光周期12h，接种在French方瓶中的10ml培养基上。用6mm不锈钢钻孔器从无菌块根上切取小圆筒。
形成根数与形成愈伤组织总量有密切相关。二者有赖于组织极性、外植体方位，栽培品种反应和培养基。芽(叶与芽)启动与极性、方位和培养基有关，只有二种栽培品种(Contennial与Yellow Jersey)形成了芽与叶。
Antoni与Folguer(1975)用WH和MS培养了3个栽培品种(Tucumana Lisa，Tucumana Morada和Centennial)。培养在继续光照200lx和23℃。用了2，4-D和椰乳但未见分化或新再生植株。形成大量愈伤组织并易于继代成功。结论：培养基变化可形成器官。Hozyo(1973)报道四个栽培品种愈伤组织形成，受2，4-D和KIN的影响。在砧木品种上嫁接成功，与形成愈伤组织能力和难易有相关。
Tsai与Lin(1973)研究几种甘薯栽培品种花药的愈伤组织形成。采用Blaydes培养基。1973年试验指出IAA，2，4-D，KIN和几种植物提取液包括椰乳的影响。暗培，30℃。大多数栽培品种以2，4-D对愈伤组织诱导与生长效果最好，可是，在继代中，以2，4-D配合IAA愈伤组织生长最好。植物提取液中，豌豆提取液对愈伤组织生长最有效。可是，Blaydes加2，4-D，CW和豌豆提取液愈伤组织生长最旺盛。
Tsai与Lin(1973)研究培养基成分和培养条件对甘薯花药愈伤组织生长的影响。采用三种盐类三角方法，测定各种无机盐和维生素的最适用量。发现继代期间变培养基pH影响；短期(30天)继代以pH6．25和6．00最好，但60天继代，最适pH是5．1和5．3。蔗糖用量以117-146mM最适。高浓度(204mM)生长迟缓，干重则比低用量的为高，后者使组织内水分百分较大。
Selgal(1975)切取甘薯未成熟叶，培养在MS加2，4-D2．3μ．M和KIN0．5μM易产生愈伤组织。使叶损伤，促进愈伤组织形成。转移到MS加IAA或NAA产生了根，但加腺嘌呤(ADE)7．4-14．8μM或KIN0．5-2．3μM，产生了根和芽叶。
Hwang(1981)研究从根的解剖上的特殊部位的器官(根和芽叶)的来源。从形成的类分生组织芽中心(MBLCS)产生芽叶和根。取根切片培养在MS。取自侧面部位的切段与中心柱的相比，形成显着较多芽叶。作者们器官形成来源于根内部的异常形成层(次生和三级)。侧面部位的切段比中心柱的产生更多有组织结构。
2．细胞悬浮培养物和酶研究 细胞悬浮物，常由愈伤组织培养建成，有时适合消毒后的组织或器官，可能产生有生活力的生长中细胞悬浮体，这是从这种组织放入无菌培养基后，剥落的细胞发育而成。但是，常用程序是用松散愈伤组织培养体放入液体培养基中，经振荡而建成的。其成功依靠产生细胞或片断的种的性质和倾向性，后者能在特定培养基中增殖。槭属，大豆属，单冠菊属，烟草属，甘蔗属等植物已能象细胞和微生物培养体建立迅速生长的悬浮培养体。虽然甘薯属的其它种如月见草种也已经成功，甘薯尚未参予其列。
Yoshida等(1970)最先采用甘薯悬浮培养体，比较研究烟草和甘薯的“培养游离细胞’的Ca2+和Mg2+离子吸收。这些悬浮体取源于培养在MS加2，4-D，NAA，KIN和盐酸硫胺素的cv．Kokei 14号愈伤组织离解而得，烟草(有叶绿素的)光培2000lx，而甘薯则暗培，二者都是25℃。烟草细胞中，可见Ca2+对K+吸收的刺激作用，但甘薯无此现象。在不同K+／Ca2+比率的培养中的甘薯细胞，K+的吸收常较高于Ca2+和Mg2+，烟草细胞则反之。还有其它关于这些离子吸收报道。
Sasaki等(1972)将cv．Kokei 14号的组织生长在改进White加2，4-D，暗培，23℃，启动细胞悬浮体。液体培养基则用Gamborg PRL-4培养基，加酪蛋白氨基酸。培养体暗培，放在旋转振荡器上80rpm，24-25℃。取培养3周的细胞放在无菌固体培养基上。3周后提取诸酶分析，以决定控制同工酶生化合成方法。
Nakamura等(1981)把甘薯外植体培养在MS启动悬浮培养物，移入相同的液体培养基中，放在旋转振荡器上100rpm，27℃。取10ml这种培养物转移到100ml新鲜培养基中，从不同植物培养不同天数(通常14和19天)的细胞继代保持。检测脱羟脱落酸降解产物对胡萝卜、烟草、大豆和甘薯细胞悬浮体生长影响。结果指出降解产物中2，3二酮古洛糖酸抑制细胞生长。并不排除其它产物的抑制作用。
Tisch(1981)用突变体栽培品种Red Jewel(IPJR)悬浮培养物研究硫代谢。研究的酶是ATP硫酸化酶。硒盐抑制生长，也研究了硫酸盐吸收。硫源是硫酸盐，半胱氨酸，谷胱氨肽和Kjenkolate。采用MS以氯化盐代换硫酸盐正常浓度。暗培，振荡250rpm，20天，酶处理12-14天。增长2-10倍(启动培养物为0．5g)。
3．营养研究 无菌人工培养排除了正常多变环境，尤其是与其它植物的竞争，微生物和动物的干扰，使之成为测定无机和有机组成的基本需要的理想方式。细胞悬浮物最为理想，是细胞生长研究的最易分析的技术。需时短、转换或加倍时期快。
关于甘薯营养研究报道，计有Gunckel等(1972)和Tsai与Lin(1973)以愈伤组织外植体为供试材料；Yoshida等(1970)研究了细胞悬浮体的问题。
Gunckel等(1972)用White加15不同有机成分组合研究愈伤组织生长，包括IAA，NAA，2，4-D，KIN，CW，蔗糖，硫酸腺嘌呤和GA3。观察到形态建成反应和根、芽诱导受极性和生长因子的影响。根启动与愈伤组织量有正相关。后者基本上与培养基组成和成分有关。认为培养基化学效应可能抵销组织固有极性。后者是形态建成反应的基础。形态建成数量差异，可能与依靠方向机理相关，后者或是质的或量的改变培养基某些组成的吸收。
Tsai与Lin(1973)研究无机盐(MgSO4，Ca(NO3)2和NH4NO3)和维生素(硫胺素、烟酸和吡哆醇)，生长素(IAA，2，4-D)和KIN对甘薯花药组织产生的愈伤组织生长影响。他们发现无机盐和维生素的作用比生长素的更为显着。
Yoshida等(1970)采用细胞悬浮体研究营养问题。观察到K+，Ca2+和Mg2+的吸收和产量与培养基的不同成分有关。加之，Yashida等企图找出细胞悬浮体对Ca2+和Mg2+细胞吸收机理间是否存在差异。
4．分离自然的或次生产物和它们的生物合成 Wernicke与Kohlenbach(1976)报道人工培养的甘薯培养体(叶肉组织)和液泡内，含有大量异绿原酸。液泡里的树脂存在于所谓绿原体中，是绿原酸过饱和产物。Oba与Uritani(1979)报道了甘薯细胞悬浮体。将萌芽组织培养在Heller培养基加维生素，2，4-D，酵母浸出液，诱导产生愈伤组织。其中很少能检测出呋喃萜(F-t)，但是细胞悬浮体中迅速产生F-t，其合成为甘薯黑根真菌病(Coratocystis furbriata)的致病物所抑制。F-t的一个组成物是ipomeamarone，由3-羟-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶(HMG-CoA还原酶)催化产生，Suzuki等(1975)报道了这种酶的一些性质。
5．胚胎发生，器官建成和植株再生 Gunckel等(1972)采用附加生长素，KIN，腺嘌呤和GA配合的培养基培养甘薯外植体，已能产生根和芽，由此取得植株再生。Yamaguchi与Nakajuma(1972)用各种细胞分裂素和ABA再生植株成功。加细胞分裂素诱导形成了不定根，只有当用ABA代换细胞分裂素时，能诱导不定芽形成。Yamaguchi(1973)得出结论，ABA对甘薯切段里的内生细胞分裂素有颉颃作用，并能促进不定芽形成，同时抑制形成不定根。
Sehgal(1975)早期工作从叶愈伤组织产生了根和茎叶。Sehgal(1978)采用甘薯不同时期的花药，培养在MS加腺嘌呤和2，4-D，产生增殖旺盛愈伤组织。但只见到二倍体组织。将把愈伤组织转移到常量MS时，再生了植株。用生长调节剂：腺嘌呤，KIN，ZEA，IAA，NAA和2，4-D的任何配合，都未取得雄核发育的单倍体。
Litz与Conover(1978)用白心甘薯的二个品种：白星和PI(植株诱导)的茎尖和侧芽，培养在MS加BA，IAA，KIN和活性炭，加以繁殖。活性炭是用来抑制愈伤组织生长过旺，以利于再生茎叶。茎尖启动培养8周后，形成了带根的可供移栽的再生植株。白星外植株的芽形成最适培养基是MS加4．4μMBA，P1315343则以4．6μMKIN和5．7μM IAA为最好。
Tsai和Tseng(1979)研究5个甘薯栽培品种的花药愈伤组织的胚形成和植株再生。采用二种基础培养基：B1aydes和MS，附加各种配合的IAA，2，4-D，KIN，ABA，2ip，BA和酵母浸出液。暗培养在27℃。加生长素与KIN的培养基诱导产生了愈伤组织，以2，4-D加KIN最好。胚形成(光周期16h)要求有ABA的培养基。他们提出ABA存在时，颉抗和调节了内生细胞分裂素，由此而取得胚形成。与Yamaguchi的研究结果相符合。认为品种间差异，是由于内生细胞分裂素浓度的差异所致。
Carswell(1981)用cv．Jewel的茎、叶和根作外植体，从事加0．5-5．4μM NAA和0．4-4．4μMBA的因子式处理。5．4μMNAA加0．4μMBA组合根和芽形成最好。在液体培养基上根生长最好，茎则以固体培养基最适。未提出植株再生。光有利于再生。
Hwang等(1981，私人通讯)用甘薯品种Contennial，Jewel和Redmar的外植体为供试材料。培养在MS盐类加Staby维生素，肌醇，抗坏血酸，BA和NAA。为了形成愈伤组织，用2．3μM2，4-D和0．5μMKIN代换BA和NAA，但是，从愈伤组织未能取得植株，植株是从亲体(外植体)组织产生的。愈伤组织增殖力强，形成了不定芽或根，单从愈伤组织来取得再生植株。
6．花药培养 从配子体染色体数产生的愈伤组织再生植株的明显有利性，已为大家所知：隐性等位基因能以表达。由此，这是鉴别突变的最好方法，尤其是隐性突变。采用单倍体创造新选系已有大量报道．
实质问题在于确证产生愈伤组织是配子是真正单倍体，而不是从二倍体组织如花药的药隔产生。因此，必须用染色体数以决定愈伤组织和再生植株是真正单倍体。由于在培养体中快速生长中的愈伤组织，可能转变成二倍体性、多倍体性，或甚至非整倍体性。至今，甘薯尚无真正单倍体，但用花药培养再生了植株。
用甘薯花的花药产生的愈伤组织取得成功。如Tsai与Lin(1973)未取得再生植株，Schgal(1978)的确取得成功，但只有二倍体再生植株。Tsai与Tseng(1979)用5种栽培品种中之一的胚，成功地取得植株，但未报道其倍数性。
Kobayashi与Shikata(1975)用几种培养基(Miller，White，Bonner和MS)和附加物(2，4-D，IAA，KIN，ABA，吡哆醇，甘氨酸，胸核苷和肌醇)。再分化植株的花粉母细胞为2n=45，指出诱导产生的植株不是单倍体。至今，甘薯的真正单倍体尚未见报道。
7．分生组织和茎尖培养 Mori(1971)是知名的甘薯分生组织培养专家。曾建立了几个种的无病毒分生组织，消除了三种最流行和为害严重的病毒：内部木栓；皱嵌镶和羽斑病毒。Elliot(1969)取cv．Kumara分生组织尖，茎尖长度影响了根启动和发育成再生植株。MS加各种生长调节剂和生长素加速根的生长和发育，最后产生再生植株。
Alconero等(1975)采用10个甘薯栽培品种的侧茎茎(分生组织的)尖长0．4-0．8mm。无菌培养在MS加NAA与IAA和KIN的各种组合，20-50天发育成完整植株，但不同栽培品种间差异很大。5．4μM NAA可缩短成株所需时间。供试150株中，有47%与病毒易感的I．setosa嫁接，未引发病毒征状。采用小茎尖可避免热处理，并可用单纯培养基(MS)在短期内取得完整植株。
Liao与Chung(1979)用热处理与茎尖培养相结合，产生了无病毒甘薯植株。取台农63的50mm长的茎端分生组织，放在38-42℃生长箱里，连续30-90天，光周期16：8h，光强33001x，未能消除甘薯黄斑病毒。取5mm茎尖培养在改进的MS上，也未能消除。但是，用曾经暴露在38-42℃28天的病毒侵染的台农63，取长0．3-0．8mm分生组织尖培养，消除病毒取得成功。在改进MS加17．7-35．5μM BA和5．7-11．0μM IAA启动分生组织培养物，培养在25±1℃，光强1501x或较低，30-50天。光周期16h，光强33001x。日夜温度各为28-32℃和25±1℃。65-100天内离体分生组织发育成再生植株。24株中有16株，无论用机械传病和，或嫁接，在牵牛上，未见病毒征状。取这些无病毒试管再生植株的单节插枝，继代在改进MS后，10-30天内发育成完整植株。
Frison(1981)将甘薯无性系培养在生长箱内32℃，直到高3cm，切取侧芽。无菌解剖出0．25-0．4mm茎尖，放在MS生长。白荧光灯5000lx29℃日温和24℃夜温，12小时光周期。当再生植株高3-5厘米时，转入泥炭团，钵装无菌土，放在防虫室内。1-2月后，将植株嫁接在I．setosa幼苗上，供测验病毒用。取经3次嫁接在I．setosa(每隔2月嫁接一次)后无病毒征状的植株的单节插枝离体培养在MS上繁殖。插枝分别培养在装有10ml增殖培养基的塑料管中。生长约2周后，核查有无真菌或细菌污染，然后供国际交流。
S．W．Moyer(1982)研究分生组织培养，作为提供高频率(cv．Jewel)已知病毒的甘薯和缩短再生所需时间的一种方法。高热处理效果并不满意。切取去叶原茎(避免带有病毒)的茎尖分生组织，培养在MS加BA和NAA培养基上，然后转移封液体培养基的滤纸桥上。6-12周再生植株移栽入土。将植株嫁接在I．setosa幼苗上，检测病毒。然后繁殖，栽于大田，评价其品种特征。启始循环中，变异超过营养繁殖的商品植株。选择暗红色皮的分生组织无性系，作为新栽培品种推广。
8．原生质体培养 原生质体分离和培养技术的进展，为培育新植物杂种和品种提供着最有希望领域。也适用于甘薯。Wu与Ma(1979)从甘薯属茎愈伤组织分离原生质体成功。纤维素酶2%，渗透剂0．8M甘露糖醇处理5小时内释放出原生质体。将它植板在固体培养基加0．47μM KIN，0．16μM NAA和0．45μM2，4-D，培养后7天内再生了细胞壁，10天细胞分裂。
Bidney与Shepard(1980)用细胞薄层营养系统，培养甘薯叶柄原生质体。原生质体培养基含有0．27μM NAA，2．2μM BA和0．3M蔗糖支持了重复分裂，3周内再生愈伤组织。细胞薄层营养法的重要因素是：低浓度生长素，逐渐降低细胞薄层里的蔗糖浓度，和注入甘露糖醇。观察到原生质体产生的愈伤组织再生根，但至今未见芽形态建成和胚胎发生。
(二)培养程序
1．选取表面光滑，形状完整，无破皮的甘薯；用自来水充分洗，包在擦手纸内用70%乙醇淋洗，任其干燥几分钟至几小时。下列程序均在无菌室内培养罩内进行。
2．用刀切去果皮，暴露出清洁、无菌表面。
3．用直径1cm木栓钻孔器钻取块根中央的圆筒根组织。
4．用无菌木栓挤压器缓慢地推出圆筒物，切成厚3-5mm圆筒形外植体，放在无菌培养皿上。
5．用无菌8时镊子夹取一片放入螺旋帽试管中(25×150mm)，装有5-15ml琼脂(0．8%)营养培养基(MS或改进的MS)，压固在琼脂表面上。
6．在试管中放一搁物架，暗培或光培(16h光，8h暗光周期)，生长4-8周。
7．待培养体大小长到接近试管直径时，转移到合适培养基上。
8a．继续培养在半固体(琼脂)培养基上，将愈伤组织切成50-100mg适当数量小块，用于继代，放在新鲜营养琼脂培养基上。
8b．这可用于几种不同生长或发育事项：包括细胞悬浮体，愈伤组织继续继代，营养研究，胚胎发生和器官建成，形态建成，植株再生和驯化。
9．这种松散愈伤组织可放入125ml瓶(装25ml培养基)或350ml三角瓶(装50ml培养基)中，培养基中放一个磁性搅拌器棒。调节转速(rpm)，把愈伤组织破碎成小片和细胞。
10a．另一方法，将愈伤组织放入三角瓶，用调料板或刀把它切碎，将三角瓶放在振荡器上，转速100-160rpm，使之碎成小片和细胞。
10b．当建成稳定的“细胞悬浮体”时，可能继代供测验用。测验事项包括原生质体培养，诱变，种质保存，分离次生代谢产物，研究酶和营养，胚胎发生，植株再生，细胞遗传研究，和细胞(生长)动力学。
最常用的细胞悬浮培养基是改进的MS，含有胱落酸。
(三)展望
除茎尖分生组织培养外，以新鲜外植体开始的其它人工培养，产生愈伤组织，由此发生相当然大的增殖。这种愈伤组织能产生：更多愈伤组织，细胞悬浮体，器官或胚培养，或再生植株。再生植株可有几种来源：愈伤组织，原始外植体或细胞悬浮体(不定根或茎)。愈伤组织或尤其是细胞悬浮体能产生次生代谢产物或生化副产品。细胞悬浮体最适于营养研究，愈伤组织也能用于评价营养的或器官的组分。
产生的胚或植株器官和再生植株，可发育成成熟植株，是作物改良包括甘薯的总目的。学者们的结论，克服和与某些食物的短缺，或克服自然病虫害或逆境的唯一途径是人工(组织)培养。
这些领域中最有成效的就其重要性依次为：分生组织和茎尖培养，花药(单倍体，雄核发育)培养和原生质体培养。
真正分生组织培养能除去种质保存中的最有破坏性因素之一。甘薯为害最大的病毒病是内栓病，Mori(1971)，Alconero(1975)，Liao与Chung(1979)和Frison(1981)深入研究了产生无病毒克隆。
单倍体培养价值，在于针对不利性状进行分离和选择，如感病性，某些营养成分低或缺少，颜色或储藏质量差，许多隐性性状，有利于固定栽培品种的良好特性，如高产和高营养水平等等。
体细胞杂交和基因转移的其它分支，是最有希望和有效潜在选择方法。至今，甘薯研究最少的一个领域，但将能以抓住关键，尤其是与其它方法相配合，以改良甘薯品种。
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