方法

出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《临床厌氧菌检验手册》第108页（824字）

1．限制性核酸内切酶 限制性核酸内切酶是一类具有严格识别位点，并在识别位点内或附近切割双链DNA的脱氧核糖核酸酶，迄今发现的限性内切酶分为三种类型，其主要特征列于表3－4中。

表3－4 限制性内切酶类别及一般性质

目前经常使用的均为Ⅱ型限制性内切酶，国外厂家已能提供上百种商品，国内也能生产数十种商品。常用的限制性内切酶有：BamHI，Bg Ⅰ Ⅱ，Ecor I，Hind I，Hind Ⅱ，Hind Ⅲ，Hinf I，Hpa I，Pst I，Pvu Ⅱ，Sau3A，xba I等。

2．DNA的提取与消化 细菌DNA的提取与前面所述方法相同，应注意的是在提取到D阄A后，应该用70%乙醇多洗DNA沉淀物几次，以洗掉样品中的盐及残存的酸、氯仿、EDTA、SDS或C_sCl等杂质。因为这些物质的存在均可抑制内切酶活性。

DNA的限制性核酸内切酶消化：每种商品限制性核酶内切酶均附有一份详细说明书，包括该酶的识别序列，最适反应条件，温度及贮存条件等技术数据。不同厂家生产的同一种内切酶反应条件不尽相同，因此在使用前应仔细阅读说明书，再根据说明书设置反应条件、时间等。

3．酶解片段的电泳 常用琼脂糖凝胶水平板电泳，常用电泳缓冲液配方(见表3－5)，电压最好保持在1～2V I cm，在25℃下的室温中电泳10～20小时。

表3－5 常用电泳缓冲液及配方

溴乙锭0．5μg／ml加入凝胶中，电泳完毕后在254mm紫外灯照射下，用装有红色滤色镜的135型相机照像。