薄层层析法分析膜磷脂
出处：按学科分类—医药、卫生 中国科学技术出版社《食物营养分析实用手册》第59页（3473字）
采用甲醇——氯仿将膜中脂类提取出来，并使膜蛋白变性，膜中脂类主要组分是磷脂和胆固醇，用薄层层析法进行磷脂的定性，定量分析测定。
试剂和仪器
(1)硅胶H－碱式碳酸镁混合物：称97克硅胶H，3克碱式碳酸镁，置研钵中研磨，混合均匀。
硅胶H－碱性硅酸镁混合物：称98克硅胶H，2克碱性硅酸镁，置研钵中研磨，并混合均匀。
(2)磷脂标准样品混合液：称磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，神经鞘磷脂，卵磷脂各5毫克，溶于10毫升氯仿：甲醇(1∶1，V／V)混合液中。
(3)氯仿。
(4)甲醇。
(5)乙酸。
(6)氨水。
(7)碘。
(8)高氯酸。
(9)定磷试剂：6N硫酸∶水∶2．5%钼酸铵∶10%抗坏血酸=1∶2∶1∶1(体积比)，配制时按上述顺序加试剂。当天配制使用。正常呈黄绿色，如呈棕黄色或深绿色不能使用。
(10)具塞试管。
(11)离心机。
(12)15×15厘米玻璃板。
(13)薄层层析缸。
(14)定磷用器材。
膜制备所用试剂的配制：
(1)pH7．4等渗磷酸盐缓冲液。
A液：称0．780克磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)溶于水，定容至1000毫升。
B液：称3．582克磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)溶于水，定容至2000毫升。
取A液380毫升，B液1620毫升混合，用少量浓盐酸调节PH至7．4。再称取17．53克氯化钠溶于其中。
(2)pH7．4低渗Tris缓冲液(Tris即三羟甲基氨基甲烷)：
A液：称2．42克Tris，溶于水，稀释至500毫升：
B液：取0．84毫升浓盐酸(比重1．19)稀释至500毫升；
取A液500毫升，B液414毫升混合，用水稀释至近于2000毫升，用6N盐酸调pH至7．4，再定容到2000毫升。
(3)肝素－pH7．4等渗磷酸盐缓冲液：将肝素溶在pH7．4等渗磷酸盐缓冲液中，每毫升含肝素500单位。
操作步骤
1．膜样品的制备
(1)红细胞的提纯：将血液置抗凝剂的容器中，每30毫升血液加5毫升肝素－pH7．4等渗磷酸盐缓冲液。以下操作在0～4℃低温下操作。取30毫升血液，3000转／分，冰冻离心机中4℃离心20分钟，使红细胞沉淀。用吸管吸尽血浆及沉淀的红细胞表面层的绒毛状沉淀层。这对于避免其他类型的细胞混入很重要。
将红细胞置于3倍量预冷的pH7．4等渗磷酸盐缓冲液中，用玻璃棒缓慢地搅拌悬浮，于4℃，5000转／分，离心15分钟，除去上清液及沉淀表层，重复洗涤3次。
(2)红细胞膜的制备：在洗净的红细胞中，按1∶40的比例加入预冷的pH7．4低渗Tris缓冲液，边加边缓慢地搅拌，置4℃冰箱中1～2小时，使之完全溶血。然后于4℃，9000转／分离心20分钟，使红细胞膜沉淀，重复洗涤，离心3～5次，最后获得白色的红细胞膜样品。
〔注〕以上制备方法适于人和大白鼠红细胞膜的分离。若制备牛、猪等红细胞膜，需在低渗缓冲液中加入1mM氯化钙，它可以防止膜的不稳定性。
(3)膜的冰冻干燥：将膜样品冷冻干燥至样品全干(冰冻干燥可以过夜)。将冰冻干燥的膜制品，置于干燥器中保存，以备膜结构成分的分析。
2．膜脂类的提取：将以上制备的膜制品重量的1／2(即15毫升血液制备的膜制品)悬浮于0．8毫升等渗的磷酸盐缓冲液中(膜不完全溶解)，加3毫升氯仿：甲醇(1∶2，V／V)，盖上试管盖，至少剧烈振荡1分钟。低速离心5分钟，在离心管里分相，缓慢地吸去上相，用细滴管穿过两相界面处变性蛋白薄层，吸出下相液(膜脂类在下相液中)，转移到已知重量的小烧杯中，置真空干燥器内，用水泵抽气。使溶液蒸发至干。称重，记录脂类抽提物的重量。
3．磷脂的鉴别
(1)硅胶板的制备：将15×15厘米的玻璃板，洗净，烘干滴数滴乙醇，用滤纸擦干。
称3克硅胶H－碱式碳酸镁混合物或硅胶H－碱性硅酸镁混合物，置小研钵中，加0．5%，pH7．0羟甲基纤维素溶液14毫升。将研磨好的浆液倒在一块准备好的玻璃板上，用玻璃棒将其铺开，轻轻颠动玻璃板，使浆液均匀分布。水平放置，使其自然干燥，然后置110℃烘箱内活化30分钟，贮于真空干燥器内备用。
(2)点样：用200微升氯仿——甲醇(1∶1，V／V)溶解2毫克干燥的脂类。
取100微升溶解的样品溶液，点在薄膜板的一个角上，距板边缘约2厘米处，点样面积要小，直径不超过5毫米。点一次待样品干燥后再点，如此重复。
另取一块薄层板，依同样位置点上磷脂的标准样品混合液(内含每种磷脂各20～50微克)。
(3)展层：采用倾斜上行法展层，展层缸内用新配制的溶剂系统平衡，进行双相层析。
第一相溶剂系统：氯仿∶甲醇∶氨水(25%)∶水=90∶54∶5．5∶5．5(体积比)。
第二相溶剂系统：氯仿∶甲醇∶乙酸∶水=90∶40∶12∶2(体积比)。
当溶剂前沿距板的顶端2～3厘米时，取出薄层板，用铅笔画出溶剂前沿位置，干燥。
第一相展层后，取出，在空气中干燥约15分钟或在放有浓硫酸的干燥器内干燥半小时。再进行第二相展层。
(4)显色：将干燥后薄层板放入碘缸内，盖好。升华的碘遇磷脂后，发生加成反应，而使磷脂的斑点呈现黄色或棕黄色。
斑点显现后，根据磷脂标准样品的相对位置和Ri值，鉴别红细胞膜中含有哪几种磷脂。
4．磷脂的定量测定：将磷脂的斑点分别从薄层板上刮下来，转移到试管中，每个样品加1毫升70%高氯酸，在190℃消化，然后测定磷含量(定磷法)。
在测光密度之前，应离心除去硅胶，测定后，从磷标准曲线上算出每个磷脂斑点中含磷量。可进一步算出每种磷脂在膜中的含量。