荧光和磷光光谱分析

出处：按学科分类—工业技术 企业管理出版社《计量专业工程师手册》第639页（3236字）

1．简介

荧光和磷光是两种辐射现象，当特定波长的光照射到分子上时，光可能被分子吸收，分子的能量升高，得到吸收光谱(如前几节所述)。处于较高能态的分子不稳定，要通过释放吸收的能量回到稳定的基态。在适当的条件下，其中一小部份将以辐射的形式放出能量回到基态。这就是光致发光现象。分子荧光和磷光是分子的电子激发态到电子基态之间的辐射，直接辐射跃迁发出荧光；从高能态(即两个电子具有大小相等、方向相反自旋的状态)“系间窜跃”到三线态(两个电子自旋方向相同)，然后辐射跃迁至基态发出磷光。荧光的寿命较短，一般为10^－8s，磷光则寿命较长，一般为10^－4s。

分子的荧光和磷光光谱具有以下特点：①由于激发和去激过程往往伴随有分子的振动和转动能量的改变，因而出现较复杂的谱带；②分子吸收能量的过程就是其激发过程，所以激发光谱的形状常和吸收光谱很相似；③发射光谱的形状和激发波长无关，因为无论激发波长如何，辐射都是从高能级开始的；④荧光光谱和吸收光谱成镜映对称关系；⑤由于发磷光的三线态能量一般比发荧光的单线态低，所以磷光光谱出现在较荧光光谱波长更长处。

并非所有的物质都发荧光或磷光，只有具有共轭双键结构，具有刚性的平面结构和有－OH、－OR、－NH₂、－NR₂－CN、－OCH₃、－OC₂H₅等取代基的分子才能发荧光。

由于荧光是物质在吸收光后发出的波长较长的光，所以溶液的荧光强度和该溶液的吸光程度及溶液中荧光物质的荧光效率有关，即

F=Φ×2．3I₀εCL (12．10－5)

式中F是荧光强度，Φ是荧光效率，I₀是入射光强度，ε是摩尔吸光系数，C是荧光物质的浓度，L是液槽的厚度。

对某一荧光物质的稀溶液，在一定频率和一定强度的射线照射下，如果被吸收的分数不太大(＜2%)，且溶液的浓度很小(εCL＜0．05)的话，则该溶液发出的荧光强度和其浓度成正比，高浓度时，由于自熄灭和自吸收等原因，使荧光强度和溶液浓度不成线性关系，而变成曲线，且随着液槽厚度的增加，在较低浓度处便发生弯曲。

2．荧光光谱仪的特性及检定

常见的荧光光谱仪有两种，即荧光计和荧光分光光度计。前者结构简单，功能也稍差，后者结构复杂，功能也强得多，图12．10－11是荧光光度计工作原理示意图。由光源(常用汞灯)发出的光投射到激发滤光片上，该滤光片只允许样品需要的激发光通过，透过的光使样品激发，产生的荧光中垂直激发光束部份通过发射滤光片，该滤光片仅允许荧光最强的波长通过，而挡住激发光和杂散光。透过的荧光由检测器检测。

1－光源；2－激发滤光片；3－样品池；4－发射滤光片；5－检测器；6－放大器；7－显示

图12．10－11 荧光光度计示意图

现代的荧光分光光度计的光路图如图12．10－12所示，光源发出的光经透镜聚焦，滤光片过滤，狭缝控制辐射能量，经光束分离器分离后到达光栅，使激发光单色化，经斩波器调制后投射到样品上。与激发光垂直的发射光经透镜聚焦，滤光片过滤和狭缝控制辐射并予处理后，到达全息光栅，获得发射的单色光，由光电倍增管接收并转化成电信号，经放大后显示出来，即为荧光光谱图。

1．－高压氯弧灯；2．－狭缝；3．－光束分离器；4．－凹面全息光栅；5．一斩波器；6．－样品；7．－PM

图12．10－12 荧光分光光度计光路图

由于荧光和磷光光谱仪的高灵敏度及高选择性，而且能获得较紫外一可见光分光光度计更多的定性信息，因此被广泛地用于科研和生产中，例如微量和超微量未知分子的结构表征和定量测定，光化学研究等。为了保证测量结果的准确可靠，国家已制定了荧光光度计和荧光分光光度计检定规程(JJG538－88，和JJG537－88)对其实行依法管理，荧光分光光度计的主要检定项目包括波长准确度和重复性、分辨率、检出限与信噪比，线性误差、稳定度、重复性、光谱校正误差等。具体指标及检定方法请参看JJG537－88荧光分光光度计检定规程。对荧光光度计的检定项目，主要有检出限、线性误差、稳定性、重复性、滤光片的透光特性等，比荧光分光光度计稍简单些。具体技术指标、检定条件和方法请参看JJG538－88荧光光度计检定规程。

3．磷光光谱仪

磷光分析仪器和荧光分析仪器相似，在荧光分光光度计中配上磷光分析附件，就能做磷光分析。磷光光谱仪由光源、激发光单色器、液槽、发射光单色器、检测器等组成。它和荧光光度计的主要区别是：

(1)液槽，为了能在低温下测定磷光，装试液的石英液槽需放在装有液氮的石英杜瓦瓶中。

(2)斩波片，由于物质发磷光时伴随有荧光产生，为了区别磷光和荧光，在激发单色器和液槽之间以及在液槽和发射单色器之间各装一个斩波片，并由一个同步电机带动。这两个斩波片可以同相也可异相进行调节。同相时，磷光和荧光一起进入发射单色器，测到的是磷光和荧光的总强度。当斩波片调节成异相时，激发光被遮断，荧光因寿命短很快消失，测到的仅是磷光。利用斩波片不仅能分别测出荧光和磷光，而且通过调节斩波片的转速，还能测出不同寿命的磷光，这是一种具有时间分辨功能的装置，是磷光光度计的一个特点，图12．10－13是磷光光度计的结构示意图。

1－紫外光源；2－遮光板；3－转动的开关；4－试样；5－光电倍增管

图12．10－13 一种单光束磷光计示意图

由于磷光光谱仪具有较高的灵敏度和选择性，并能获得比紫外可见光谱仪更多的定性信息，因而被广泛地用于基础研究、光化学研究中。磷光分析法在有机、生物、医药及临床检验等领域中得到了应用，它和荧光光谱法互为补充，成为痕量有机分析的重要手段。

【参考文献】：

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［8］罗涤明，计量技术，1993年第6期。

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