直接计数法

出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第115页（2734字）

一、细菌总数测定

(一)用血细胞计数器计算 用计算白细胞的吸管吸取菌液(如为活菌，小心)至0．5记号处，再吸稀释液(0．2%升汞水溶液100ml中加浓盐酸2ml和石炭酸一品红两滴)至11记号处，摇匀后弃掉前几滴，然后滴一滴在计算室内，加盖玻片，15min后计数，最少计20小格，求得一小格中细菌平均数，再乘以80000000，即为每ml的细菌总数。因为计算室每小格的长、宽均为1／20mm，高度为1／10mm，故每小格容量为1／20×1／20×1／10mm³，即1／4，000mm³，即1／4000000ml，又因菌液曾在吸管中稀释20倍，故每小格中的细菌数，实际相当于1／80，000，000ml中的细菌数，故乘80000000为每ml中的细菌总数。如菌液太浓，计数不便，可以稀释百倍或千倍以后再进行计数，最后再乘以100或1000。

(二)显微镜直接计数 以牛乳为例将计数方法介绍如下。

1．抹片制备 取一纸片，画一方格，面积为100mm²。放载玻片于纸上，使方格位于玻片中央，以微吸管吸取0．01ml牛奶(或其他被检菌液)，以方格为界使均匀涂布于玻片上，置室温干燥。

2．染色 干燥玻片以甲醇固定(可用染色缸)30s，转移到二甲苯中2min以去脂肪(无脂肪的菌液可免去二甲苯这一步骤)，再浸于酒精中2min以去二甲苯，水洗去酒精，用骆氏美蓝染30s(其他染料亦可)，水洗，干燥。

3．计数 用测微器测出所用油镜的视野半径，则每视野的面积为πr²。整个被检菌液为0．01ml涂布于100mm²的面积上，则100mm²面积上将具有100mm²／πr²(单位是mm²)个πr²的视野。计算x个视野(一般为100或50个视野)中的细菌数，假设其总数为n，则平均每视野具有n／x个细菌，故每ml被检菌液中的细菌总数计算公式为：

二、活菌数测定

(一)倾注平皿法 此法很常用。取灭菌试管9支(含菌数如不很多，可少)，内有灭菌盐水9ml，取1ml被检菌液加到第一管，混匀后取1ml加入到第2管，同时从第1管再取1ml置1号消毒的空平皿中；换吸管，将第2管中的菌液混匀，从第2管中吸1ml置于2号消毒空平皿中，又取1ml加到第3管；换吸管，依次操作。则1～9号平皿中均有1ml的稀释菌液，其稀释度为10^-1～10^-9。向各平皿中加入融化后冷至45℃的含琼脂而又宜于被检菌生长的培养基，与菌液充分混匀，凝后置37℃培养24小时(生长慢的细菌可延长)，选菌落为30～300的平皿计菌落数，乘以稀释度，即为1ml中的活菌数。每一试管中的菌液也可做2个、3个平皿的重复，计算时取其平均数。

(二)最大可能值法，简称MPN法(系Most Probable Number的缩写) 将被检菌液分别取10ml、1ml、0．1ml、0．01ml接种到适宜的液体培养基中，每一个量接种三管，即10ml的接种三管、1ml的接种三管……。培养基的量应是接种量的九倍以上。有9ml或10ml的培养基，可供接种1ml、0．1ml、0．01ml之用；而供接种10ml的被检菌液的培养基，要就是90ml以上(用三角瓶)，要就是用50ml体积的大试管，盛以双倍浓度的培养基10ml，加入10ml被检菌液后变成20ml总量的正常浓度培养液。

接种好后，培养24～48h，取出观察各管有无细菌生长，有生长者记+号，并得出不同接种量的各自的3管中有几管有细菌生长，据此得出一个数字，根据数字查表，便得出被检菌液中所含活菌的最大可能值。

表7-1 接种对照表

查表，3100这一数字，取前两位31，被检液中每100ml含菌数最大可能是45个。若数字为3331，则取后两位31，查表为4500个／100ml。若数字为3333，则应重做，从0．01ml做起，加做0．001ml、0．0001ml及0．00001ml，仍可用此表查，查出的数字要乘以若干个10倍，如0．0001ml及0．00001ml的数值，用表上0．1ml及0．01ml的数值，则乘以=1000倍。用MPN法，接种量到0．01ml以下时，可稀释后接种。例如原液稀释100倍后接种1ml(或0．1ml)即等于接种了原液0．01ml(或0．001ml)，但此法不如倾注平皿法精确(倾注平皿法也有误差)，且污染管往往不易为肉眼看出而引起判断失误，但由于其简便可行，故仍为细菌计数法之一。

表7-2 100ml中被检菌数的MPN表

(三)滤膜技术(membrane filter techniques)计数 被检样品，如空气、水、食品卫生中所涉及的某些材料等，每ml含菌数过少时(有的每ml含菌数个或平均不到1个)，需要集菌后计数，以减少接种量和培养基量，而用微孔滤膜技术。

表7-3 微孔滤膜有12个型号

* 1mmHg=133．32Pa。

孔径大的滤膜，供清朗液体，小的可截留病毒。供细菌计数用者，多用HA型、PA型。

将微孔滤膜上下各放一张滤纸，装于微孔滤膜器上，高压灭菌后，使一定量(例如1万ml或1千ml或5百ml)的气体、水或被检液体在一定流速下通过滤膜，细菌被留在膜上，将滤膜无菌手术取下，培养，计数。

作需氧即可生长的细菌计数时，将过滤后的滤膜含细菌的一面朝上，贴于富有荣养的琼脂平板上，再加上0．5ml的液体培养基保持滤膜的潮润和营养性，培养后取出滤膜，置含少量脱脂棉的平皿中，以万分之一的美蓝水溶液覆盖，使菌落着色比滤膜深，即可计数。如作厌氧菌计数，可将滤膜的含菌面朝下，贴于琼脂面上作厌气培养或在滤膜上覆盖一层同下面一样营养成分的琼脂，上下两层琼脂均含氢硫基乙酸钠(Sodium thioglycollate HSCH₂ COONa)达0．5～1．0%，以助厌氧环境形成，培养后取出滤膜计数如上。滤膜亦可留在琼脂面上或琼脂中，不染色，用倒置显微镜低倍放大计数。