布氏杆菌属
出处：按学科分类—农业科学 中国农业出版社《兽医微生物实验诊断手册》第302页（8734字）
受布氏杆菌感染的家畜主要是牛(包括牦牛)、绵羊、山羊、猪、犬，骆驼亦易感。母畜主要表现为流产，公畜为睾丸炎、副睾炎，但马的感染则主要表现为耆甲瘘、项瘘。
一、病原特征
(一)形态与染色 布氏杆菌属为革兰氏阴性菌，非抗酸性，无芽孢，无荚膜，无鞭毛，不运动，球杆状，大小为0．5～2×0．5μm。组织涂片或渗出液中常集结成团，且可见于细胞内；培养物中多单个排列，少数成双或呈短链，故历史上曾称它为微球菌、链球菌。布氏杆菌属有六个种，即牛种(Br，abortus)、羊种(Br．melitensis)、猪种(Br．suis)、绵羊种(Br．ovis)、犬种(Br．canis)、沙林鼠种(Br．neotomae)，只前五种感染家畜。六个种的区别见后表。
(二)培养特性 布氏杆菌需氧兼性厌氧。初次分离时，牛布氏杆菌和绵羊布氏杆菌需要10%的CO2。最适生长温度为37℃、pH为6．6～7．0。在普通营养琼脂上可生长，但贫瘠，血琼脂、血清葡萄糖琼脂、胰胨琼脂、肝浸液琼脂、血液马铃薯浸液琼脂等生长较佳。
布氏杆菌生长较慢，特别是初次分离时。最快的2～4天，最慢的2～4周，实验室保存的菌株1～2天可现生长。在血清葡萄糖上的菌落为圆形、光滑、边缘整齐、潮润闪光、低隆、半透明、透光看微现蓝色、直径1～2mm，继续培养可达3～4mm，隆起度增加，最大的菌落可达8～9mm。肝汤琼脂上菌落带淡黄色或黄褐色，在马铃薯斜面上大多数菌株现暗黄色或暗褐色的色素，培养天数多的色素较深。血琼脂上不溶血。
(三)生化特性 布氏杆菌生化活性不甚活跃，不产生吲哚，不液化明胶，VP和MR均为阴性，对多数糖类与醇类不发酵，能使其中一些氧化。能还原硝酸盐为亚硝酸盐，接触酶阳性，氧化酶多为阳性，产生尿素酶。猪布氏杆菌1型产生大量硫化氢，牛布氏杆菌次之，羊布氏杆菌仅产生微量或不产生硫化氢。染料抑菌作用亦有助于区别各种布氏杆菌，一些牛种不能在五万分之一的硫堇中生长，大多数猪种不能在五万分之一的碱性复红中生长。
布氏菌有光滑型与非光滑型之分。在正常情况下，牛种、羊种、猪种均为光滑型，在不利的生长条件下也可变为非光滑型。而绵羊种和狗种现仅知是非光滑型。
光滑型(R型)菌落圆形，边缘整齐，表面光滑潮润；反光观察时呈蓝白色或乳白色，透光观察时带蓝色，半透明。
非光滑型分为粗糙型(R型)与粘液型(M型)两种，这两型菌落都比光滑型菌落大，表面呈颗粒状或粘液状，透光观察时呈污白色或褐色，半透明或不透明。
光滑型培养物在0．1%吖啶黄溶液中不发生凝集，R型培养物呈颗粒状凝集，M型培养物呈絮状凝集。用非光滑型培养物免疫动物所制的抗R型血清，能凝集非光滑型培养物，但不凝集光滑型培养物，反之亦然。
光滑型布氏菌表面含A抗原物质及B抗原物质，不同种或不同生物型的光滑型布氏杆菌所含A物质或B物质的多少有差异，对鉴定种或生物型有帮助(参阅表12-9)。
布氏杆菌属的DNA，G加C含量为55～58Mo1%。
二、检验步骤及方法
查畜群布病，有血清学检查与细菌学检查，并应与畜群情况及临床检查相结合。
(一)血清学检查
1．试管凝集试验 此为法定检疫方法，详见总论的凝集反应部分。我国规定，牛、马、骆驼的血清凝集滴度(价)在1∶100以上判为阳性，1∶50为可疑；猪、羊、狗在1∶50以上为阳性，1∶25为可疑。可疑动物3～4周后采血重检，重检如仍为可疑，在牛、羊则判为阳性；在猪或马，当受检畜群既无布病症状出现而同群的其他马、猪又无阳性反应时，可判为阴性。
对凝集反应的阳性判定标准，1967年联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)布病专家委员会均规定，牛的阳性凝集滴度为100IU／ml、羊为50IU／ml。经我国标定，即相当于我国的牛被检血清凝集价为1∶100、羊被检血清凝集为1∶50，故我国应用的标准可以认为与国际标准同。至1982年，国际兽医局在《国际动物卫生法规》中对进出口动物的布病检疫作了新的规定，即凡未接种过布病菌苗的牛和猪，凝集滴度必须在30个IU／ml以下，羊必须在15IU／ml以下方认为阴性，不少先进国家采用了这个标准，我国对外也采用，但对内检疫还是用前述标准，即被检血清试管凝集价在牛等1∶100以上、羊等1∶50以上为阳性。人的凝集反应一般以1∶100以上认为是阳性。
2．平板凝集试验 取一清洁玻璃板，用蜡笔划一排10cm2左右的小方格，从左向右第一格到第四格依次加入被检血清0．08、0．04、0．02、0．01ml，接着每格加入平板抗原0．03ml于血清附近，用一牙签或火柴棒，按从血清量少到血清量多的顺序(即从右向左)，将各格中的血清和抗原混匀，同时轻轻将玻板转动，温度以30℃左右为宜，冬天可在酒精灯火焰上微温，5min内读结果。血清量0．08、0．04、0．02、0．01的各格，相当于试管法中的血清稀释度1∶25、1∶50、1∶100、1∶200，假若第一、第二两格凝集，其凝集价为1∶50。平板法操作简便，还适于野外使用。经标定，我国生产的平板抗原，符合国际标准。
平板抗原含12%氯化钠，可抑制blocking antibody(阻止抗体)的封闭作用，故阳性检出率比试管法高，在老的病羊群尤其是如此。
3．凝集反应的一些辅助试验 为了消除凝集反应中的某些假阳性反应，有下列的辅助方法。
(1)2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol)凝集试验 用生理盐水将被检血清作1∶6．5的稀释(0．2ml血清加1．1ml盐水)，加入等量的0．2M的2-巯基乙醇(0．89ml的HSC2H4OH加于9．11ml水中)，混匀(此时是1∶12．5的稀释)，在37℃下置30min后，按试管法用生理盐水对血清作倍比稀释，每管留稀释的血清0．5ml，各管再加入抗原0．5ml，37℃下20h后读取结果；与此同时，取未经2-巯基乙醇处理的同份血清按常规作试管凝集试验，比较两者的凝集价。处理的除以未处理的，再乘100，即两者差异的比值，例如经2-巯基乙醇处理过的血清凝集价为1∶50，而未经处理的同样血清为1∶200，其比值为
×100=25%，但比值达多少认为阳性，尚无一致意见。有人认为，处理前为阳性反应的效价，处理后为阴性反应效价，且畜群及被检畜均健康，可判为阴性。
(2)虎红平板试验 引起非特异性反应IgM类抗体，在酸性状态下将失去活性。将布氏杆菌抗原混悬于pH3．6～3．8的酸性缓冲液中，制成酸性缓冲液抗原，与血清作平板试验，可排除由IgM引起的假阳性反应。此种抗原常加虎红(四氯四碘荧光素钠盐)着色，故常称为虎红抗原试验，美国加拿大等以纸片代玻板故亦称卡片试验。此种抗原我国亦生产。
试验时取血清、抗原各0．03ml于玻板上混和，5min内读结果。
4．其他形式的凝集试验
(1)乳汁环状试验 患畜奶中有凝集素，可用染色抗原(曾用苏木紫将抗原染成蓝色，因制备较繁，后用三苯基四氮唑将抗原染成红色)作乳汁环状试验检测。检测时取鲜奶1ml(可以是10头牛以下的混合乳，也可是一牛之奶，亦可是某牛一个乳房的奶，视检验目的而定)，置于小试管中，加入染色抗原二滴(约0．05ml)，混匀，37℃水浴1h，取出看结果。如凝集，被凝集的有色抗原将随乳脂上浮到乳柱表面，形成红色(或蓝色，如用苏木紫)环，乳柱为白色；如不凝，乳柱为红色(或蓝色，如用苏木紫)，上浮的乳脂环为白色。
此法既可用于检查混合奶，以了解牛群的布病情况，亦可检查某一牛或某牛的一个乳房。在乳场内结合挤奶就可以做，一小时后获结果，但结果不很精确。
(2)乳清凝集试验 先离心去乳脂，后以凝乳酶(1)使牛奶凝固析出乳清，以乳清代血清，从1∶5开始作试管凝集反应，三个月以内未经注射疫苗的牛，即使是1∶5乳清为阳性，可认为阳性牛，乳清凝集价与带菌有一定关系，乳清1∶40以上呈阳性者，多能从乳中分出布氏杆菌。
(3)精液凝集试验 公畜(特别是公猪)患布病时，其精液浆中有凝集素。取精液按常规作试管凝集，凝集价为1∶5以上者为阳性。
5．补体结合试验 补反也是比较特异的一种反应。慢性布氏菌病的患畜，凝集反应往往检测是阴性，而补反是阳性。许多国家承认补反，和试管凝集反应一样，是法定的布病检疫方法之一，操作从常量趋向于微量。
补体结合反应的操作、原理，参阅总论中血清学反应的补体结合反应部分。
用于布病的补反抗原，有市售的，亦可以凝集反应抗原稀释60～70倍用。被检血清经56～58℃(驴骡血清为62℃)加热30min后，稀释10倍应用。反应时补体用1个单位，溶血素用2个单位。
如用常量操作(每一成份0．5ml，每管共2．5ml)可按表12-7进行。
表12-7 布氏菌病补体结合试验
亦可参照总论中补体结合反应微量法，在塑料板的孔中进行，每一成分加1或2滴。
6．间接溶血试验 抗原、抗体、补体三者结合于红细胞表面，不需溶血素存在，可使红细胞溶解，称为间接溶血试验。此法不如补反精确，但操作较补反简单。
取一定量的(例如1ml)4%绵羊红细胞悬液与等量的布氏菌补体结合抗原混合，在37℃致敏30min，离心，弃上清，用生理盐水洗涤3次，取此致敏血细胞以盐水配成1%悬液，加于塑料板孔中，每孔25μl，再加入不灭活的待检血清25μl、1∶20补体25μl，混匀，置37℃30min，取出观察结果，若溶血，表示被检血清中有布病抗体，否则无。
7．抗球蛋白试验 布病患者(畜)有一种不完全抗体，亦称阻止抗体，它是球蛋白，可和菌体结合，但不发生凝集。这种抗体可以用抗球蛋白试验法检查出来，即与不完全抗体结合的布氏杆菌遇相应的抗球白抗体，可发生凝集。
当被检血清作常规试管凝集试验，无凝集或凝集价甚低时，可将各试验管置离心机沉淀，使菌体下沉，吸弃上清，加生理盐水3ml混和再离心，如此这样洗涤3次以去除未吸附于菌体的被检血清，加石炭酸生理盐水至原来的量(1ml)，加适当稀释度(或就用1∶50)的相应的抗球蛋白血清一滴于每一管中，再置37℃下22～24h读取结果，凝集价多高即表示阻止抗度的滴度，高到多少才判为阳性，同试管凝集反应。
相应的抗球蛋白血清，指抗牛球蛋白血清(如被检血清是牛)、抗人球蛋白血清(如被检血清是人)等等，可购得。如自制，可参阅本书血清学反应的免疫荧光抗体部分，从该种动物(如牛、人等等)血清中提取球蛋白免疫于兔，然后取免疫兔的血清与该动物血清作沉淀反应，测得免疫兔血清能起反应的最高稀释度(效价)，使用时用效价的4～10倍浓度，如效价为1∶2560，则使用1∶256～1∶640的稀释度，此即上段中所指的适当稀释度。
上述方法复杂，有人提出简化法，即仅取1∶10的被检血清作试管凝集，作用后离心洗涤同上，再加入抗丙球蛋白血清，如发生凝集，表示阳性反应。有的国家已用这种方法来监测畜群布病。
(二)细菌学检查
1．抹片检查 取流产胎盘绒毛叶组织、流产胎儿胃液或阴道分泌物作抹片，火焰固定，用改良的Ziehl-Neelsen氏石炭酸复红原液(碱性复红1g，溶于10ml纯乙醇中，加入90ml的5%石炭酸水溶液，混匀即成)的1∶10稀释液染色10min，用0．5%醋酸溶液脱色20s，自来水冲洗，用1%美蓝复染20s，镜检。布氏菌染成红色，背景为蓝色。布氏菌大部分在细胞内，集结成团，少数在细胞外。衣原体和胎儿弧菌也引起流产，在抹片中也染成红色，但形态与布氏菌不同，可区别。抹片如用荧光抗体法染色检查，效果更好。
2．培养检查 当分离出布氏菌时，即可作布病的确诊；但分离不出布氏杆菌时，不能否定布病的存在，特别在慢性病例，应从临床表现、血清学检查及流行病学的各方面看问题。分离鉴定工作较费时费材料。
患布病母畜可能流产(头胎流产多)也可能不流产。无论流产与否，胎盘(特别是有病变的绒毛膜、子叶)、阴道分泌物及乳汁含菌，胎儿的淋巴结、肝、脾、第四胃内容物也可含菌；患病公畜的精液也含菌。血液中含菌机会不多，限于急性发热期，为时甚短。
作细菌分离时，将被检材料接种于两个同样的选择性培养基(见本节最后附录)平皿，接种乳汁时取乳脂(可离心或置冰箱越夜使乳脂上浮)，接种血液时要加上两瓶血清葡萄糖肉汤或胰酶蛋白胨肉汤或血清马丁汤，每瓶肉汤250ml，加被检血10ml。两个平皿、两瓶肉汤，一置10%的CO2环境37℃培养，一置寻常的37℃温箱培养。逐日观察，如有生长，移植于血清葡萄糖琼脂纯化，鉴定。一个月内无生长，判定为培养阴性。布氏杆菌的初代分离，通常在3～10天即可出现生长。
3．细菌鉴定 细菌分纯后，如符合下述全部条件，可认为是布氏杆菌属的细菌，即细小的革兰氏阴性球杆菌或杆菌，无芽孢、荚膜、鞭毛，不运动，需氧，接触酶阳性，糖发酵、MR、VP、靛基质、柠檬酸盐利用等反应均为阴性，光滑型菌落能与布氏杆菌阳性血清凝集，粗糙型菌落能与布氏杆菌R血清凝集。初次分离的绵羊种、狗种均为粗糙型。做凝集反应时可用玻板反应，先加阳性血清一滴，在血清旁加盐水一滴，用铂圈取琼脂上细菌浮悬于盐水中，应不凝集(如凝集，说明有自家凝集，不能用)。再将菌液与血清混和观察结果，由于用活菌做，较快，但要很注意安全。较妥善法是括取琼脂上生长物浮悬于0．5%石炭酸生理盐水中，热至100℃1h杀死细菌，再调节细菌浓度到市售凝集抗原浓度，用已知阳性血清作凝集反应(玻板或试管)，并以已知抗原作对照。
革兰氏阴性杆菌能与布氏杆菌阳性血清起凝集反应者有下列细菌，其区别如表12-8。
表12-8 布氏杆菌与其他革兰氏阴性杆菌的区别
关于定布氏杆菌的种、型，参阅表12-9。
表12-9 布氏杆菌属中，种与生物型的区分
注：
1．符号说明 +——几乎全部菌株均为阳性；(+)——大部菌株为阳性；▲——牛种第3型能在1／25000的硫堇中生长，而牛种第6型不能；*——沙林±——阳性约半；(-)——大部菌株为阴性；-——几乎全部菌株为阴性；鼠种能在1／150000硫堇中生长。
2．RTD指某噬菌体最高稀释度仍能使相应敏感菌株裂解所用的量。
3．牛种无第8型，因该型菌株未保存下来，导致国际上未予认可。
关于表中的各项说明。
a．对CO2的需要 同一培养物初次分离时只有在10%CO2下生长，无10%CO2环境不长。
b．硫化氢的产生 将待检菌接种于琼脂斜面，用饱和醋酸铝滤纸条塞放在试管口边，每日换一次滤纸条，共4次，观察滤纸条是否变黑及变黑程度。猪种1型产生H2S最多，滤纸条色深，4天都产生。
c．染料抑制生长试验 取两瓶融化好的肝汤琼脂(或葡萄糖琼脂融化后于45～50℃时加入血清成血清葡萄糖琼脂，并维持此温度)两瓶，每瓶各加入琼脂量1%的1∶500的硫堇或碱性复红的酒精溶液，混匀，使最终含染料达五万分之一，倒平皿，凝固后置冰箱中备用。用时取被检菌在平皿上涂布，培养，观察生长结果。
d．与单价的特异血清凝集 向北京中国兽医药物检定所(原中监所)购单价特异的A、M、R三种血清，分别与被检菌作玻板凝集反应，以了解被检菌的表面抗原结构。
e．噬菌体溶解试验 噬菌体的溶菌作用有选择性，对菌种鉴定有帮助，常用的表12-9中列的前四株噬菌体，中监所有保存。试验前，将易感细菌(宿主株)在液体培养基繁殖到生长旺盛时，滴加噬菌体，使噬菌体繁殖，液体应从浑浊转向清亮(约1～2天)，通过滤器除菌，滤液即作为噬菌体。将此滤液(即“噬菌体”)作不同稀释度与宿主菌作用以得出含噬菌体滤液的滴度，根据滴度稀释成常规试验量(RTD)。
将待检菌株的菌液涂布于血清葡萄糖琼脂平板(或其他宜于生长的琼脂平板)，干后，滴一滴已知噬菌体的RTD于其上，置37℃培养，若滴入噬菌体处出现一片无菌苔生长的溶菌斑，表示完全溶解，即表上的“溶”；若在菌苔上出现小的分散的不连续的溶菌斑，表示部分溶解，即表中的“部溶”；若滴有噬菌体处的菌苔生长与未滴处一样，表示不溶解。
噬菌体法，操作、设备远较下述的基质氧化要简单得多。噬菌体作用特异，只对布氏杆菌起作用。
f．对基质的氧化 布氏杆菌能氧化一些糖、醇、氨基酸，但不一定能用酸碱指示剂显出，用呼吸器均可测出。其方法为将被检菌在血清葡萄糖琼脂上培养48h，刮取菌苔，以pH7．2的磷酸盐缓冲液(0．908%的KH2PO450．8ml加49．2ml的1．187%的Na2HPO4·12H2O)离心洗涤3次，配成细菌浓度为每ml含氮0．9mg(以微量凯氏定氮法测得)。取此菌液约半，置100℃水浴中加热半小时以杀菌，作为死菌液以便与另一半的活菌液在测定时作为对照。将待试的基质(糖、醇、氨基酸等)制备成10%无菌液(除混旋瓜氨酸可经121℃15min高压灭菌外，馀均用过滤除菌)备用。所有菌液的稀释、溶液的配制均用pH7．2的磷酸盐缓冲液。操作时以丸氏呼吸器测O2消耗，用死菌液作为活菌液对照，以便确定该基质存在时，活菌是否消耗O2(+或-，如表所示，定性)，或测定每mg含氮量的活菌液在一定时间内所消耗的O2量(定量)。
至于瓦氏呼吸器的操作，因需较大篇幅，请参阅有关细菌生理或细胞生理、植物生理的书。
布氏杆菌选择性培养基做法如下。
最常用的是Kuzdas——Morse二氏培养基，即每100ml基础培养基中加入抑菌药物：放线酮10mg(配成1%溶液，冰箱中保存期半年)、杆菌肽25单位(配成2500单位／ml，冰箱保存期半个月)、多粘菌素B6单位(配成6000单位／ml，保存于-20℃，亦可用国产多粘菌素E，用量同)，有的还加乙基紫使最后浓度达八十分之一溶液备用。
基础培养基可用血清葡萄糖琼脂、血清马铃薯浸液琼脂、胰酶消化蛋白胨琼脂、血清马丁汤琼脂等。配时将无血清的琼脂培养基溶化，45～50℃时加入各物及血清，混匀，倒平板。