应用
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第165页（8737字）
(一)拯救杂交不亲和杂种
近代育种中，常用异种和异属杂交，企图把野生种有价值基因转移到栽培种中去。不亲和性是常有问题，产生含有败育胚的皱缩种子。Wardlaw(1965)汇综了异种杂交种子败育现象。N．rustica自幼胚珠内，母体组织的维管束与珠皮和胚乳相连。而异种杂交黄花烟草×Niglutinosa和黄花烟草×普通烟草母体组织维管束只与珠皮相连，而未能伸入胚乳。结果造成珠心过度生长，胚乳：珠心比率低。其它植物异种杂交种子发育失败也是如此。这类受精后(合子后的)解剖特性反常，叫体质不育性。Wardlaw概括为“许多异种杂交的种子败育，反常发育的最初迹象典型地发生于胚乳。”胚乳发育失败，导致胚饥饿和败育。体质不育性也可能是胚-胚乳不亲和性，充分发育的胚乳产生毒素，杀死其胚。例如Lilium apeciosumalbum×L．annuum，在杂交种子中，胚和胚乳发育充分，但未能取得幼苗，由于种子储藏或浸种期间胚的解体。
在败育前，取杂种胚培养，可能克服这种合子后障碍。Laibach(1925，1929)首次指出胚培养技术可用以拯救异种不亲和杂交。Lilium perenne×L．austriacum中，他注意到种子大大地皱缩了，很轻，不能发芽。取其胚培养在含蔗糖的湿滤纸上或棉垫上，能以产生杂种植株。迄今胚培养已成标准技术，描述于育种课本中。
培养时胚发育时期很重要，胚愈不成熟，愈难培养，需要很复杂的营养成分。同时，随着胚年龄增加，成活胚数减少。需经测验才能确定其最适关系(发育最大程度与胚数间)。Raghavan(1977)和Collins与Grosser(1984)曾汇综了异种和异属杂交胚培养拯救成功之例。
禾谷类作物之例，如节节麦×Triticum boeoticum有生活力杂种植物的产生(Gill等，1981)。其种子败育主要由于杂种胚乳核分裂较快而不是反常。显然在种子发育5-10天时，杂种胚乳败育，从10天时储藏蛋白质合成停止，指出杂种胚乳完成了败育过程。培养10-20日龄胚200个，取得6株有生活力杂种。如果能以解剖和培养5日龄胚，杂种成功率可能有所改进，由于胚乳很快解体，必然会对杂种胚成活力产生不利影响。
小麦族的多倍单倍体，可由bulbosum法合成。Agropyron tsukushiense×球茎大麦结实高，但需用胚培养取得幼苗。授粉后14天取未成熟种子。取出杂种胚，接种在加YE固化培养基，暗培直至发芽。培养过程中，父本球茎大麦染色体自发丢失。杂种细胞只含有母本染色体。
洋葱×葱正反交结实很差。大多数受精胚珠内胚乳发育不全。只有少数胚乳液。许多杂种胚在长0．3-0．6mm时稍见畸形。长0．8-1．0mm胚死亡。授粉后28天种子变黑、皱缩。含有少量胚乳液和褐色死胚。授粉后35天完全死亡。长0．5mm未成熟胚培养在规定培养基成功。
为了把抗病性、耐逆境性、高产和优质掺入栽培品种，必需克服杂交不亲和性障碍。陆地棉×树棉正反交(异种杂交)经下列处理取得杂种植株。用GA和NAA喷杂种棉铃，继之胚培养克服不亲和性。White培养基加秋水仙素培养杂种胚，以克服F1不育性。20日龄胚在培养中成活率低，30日龄胚60%，40-45日龄胚80%生存。约40%再生株可供移栽。
多年生大豆的野生近缘种是潜在有价值种质资源，可供大豆育种利用。它具有很不相同的生长型和适应性，以及耐旱、热和寒性，日长不敏感性和抗病性，如能转入栽培大豆，很有经济价值。Broue等(1982)进行栽培大豆与多年生种控制授粉。大多情况下，不长荚，授粉花3-4天内干枯脱落。但少数杂交有荚启动。授粉后5-35天杂种胚常见败育，或由于杂种胚乳解体，未得种子。经采用胚和胚珠培养。授粉后11-33天取荚，仔细解剖取胚，培养在“看护胚乳”(授粉后10-15天培养的大豆自交种子中取得的胚乳)中。如胚过少难于从胚珠取出而不受损伤时，可用整胚培养。结果取得5株不育杂种。为开发多年生Glgcine种的不同种质资源用于大豆育种开辟了道路。
(二)无性繁殖
1．禾本科 近年来才取得禾本科人工培养克隆繁殖成功。由于幼年组织具有高再生潜势的性质，从胚原组织诱导许多禾谷类作物和饲草发生器官建成和体细胞胚胎发生。Vasil等(1980)用珍珠粟原生质体取得胚胎发生和再生植株代表着证实禾本科细胞全能性的最先进工作。1984年以来已有若干学者培养水稻原生质体植株再生成功。
由于禾谷类成熟胚产生的愈伤组织无形态建成潜力，曾用未成熟胚培养鸭茅成熟胚产生的愈伤组织继代后取得再生植株。这可能由于它的成熟胚很小，发育程度与组织化相当大粗种子的未成熟胚之故。
与诱导胡萝卜体细胞胚相似，2，4-D是禾本科起始和继续培养中促进全能性表达最有力的化合物，大麦，玉米，珍珠粟，鸭茅，水稻，黑麦，黑麦草，高粱，小黑麦和小麦胚培养结果证实之。Heyser等(1982)报道生长素(2，4，5-T)诱导燕麦再生愈伤组织比2，4-D更好。生长素2，4，5-Cl3POP也是从黑麦、小麦和小黑麦胚诱导和保持再生的愈伤组织有效生长调节剂。有时2，4-D与KIN配合比2，4-D更适于胚原愈伤组织增殖。单用KIN培养大麦未成熟胚能以诱导类胚结构。Green(1983)发现L-脯氨酸在2，4-D培养基中，对玉米有可靠的启动胚原愈伤组织的决定作用。
将离体未成熟胚以盾片向上接种在琼脂表面上，常能产生具有形态建成潜力的愈伤组织。如果将盾片向下接触培养基，则从玉米胚轴节区域而不是盾片产生胚胎发生愈伤组织，或从小麦外胚叶产生。离体鸭茅成熟胚根鞘产生的有胚胎发生和形态建成愈伤组织能以增殖。禾本科再生的愈伤组织常是紧密和不透明的，表面光滑。Green(1982)直接从玉米未成胚盾片表面发育成具有高度胚原活性的松散愈伤组织。许多具有潜在形态建成的培养体，经多次继代仍能保留，有时甚至长达二年，仍能产生大量胚。
培养后不定芽和体细胞胚的继续发育对2，4-D敏感。为了取得正常发育的再生植株，要把这种组织转移到无生长素培养基上，或将生长素用量降低。有时用ZEA，IAA，NAA，ABA，CW和激活的液体培养体以加强再生植株效率。
涉及玉米渗透压要求报道有矛盾。Green(1982)强调用低蔗糖浓度(2%)于愈伤组织诱导和增殖，高蔗糖(6%)用于再生植株发育时期。Vasil等(1983)相反，早期用3-12%，后期用2%。这种矛盾可能由于愈伤组织形态(松散对紧密)和来源(盾片对胚轴节区域)不同之故。
大麦胚培养中观察到2，4-D的诱变效应，尤以其浓度增高到18．0μM。产生了细胞学和表型变异。McCoy等(1982)用六倍体燕麦发现细胞遗传改变，常发生于再生植株。Karp等(1984)指出小麦192再生株中有29%是非整倍体植株，染色体数38-45。相反，Edallo等(1981)发现110再生玉米植株中，只有二株非整倍体，McCoy等(1982)在124再生玉米植株中，只有3株细胞学反常植株。Karp(1984)认为玉米反常植株频率较燕麦、小麦的为低，可能由于倍数性不同所致。由于玉米是二倍体，针对染色体变化的缓冲作用低，对非整倍体耐性低。所以，培养体中虽有非整倍体细胞，较难得到它的有生活力植株。Larkin等(1983)用未成熟小麦胚为外植体，观察到广大的形态和生化特性的体细胞克隆变异，这些再生株是从芽器官建成而来的。也发现变异体性状在种子繁殖二代中表现可遗传的，受单基因和数量遗传控制。不断产生的信息意味着经胚胎发生再生株的遗传稳定比器官建成再生的为高。
2．松柏 Sommer等(1975)首次从长叶松胚培养再生完整植株成功。当培养在加BA与NAA培养基时，沿着子叶产生许多不定芽。经取芽转入加或不加生长素基础培养基后，有些生根，发育成旺健植株。用相似技术培养下列种的胚取得了再生株。这些种是湿地松，P．radiata，P．regida，P．sabaniana，P．toeda，P．virginiana，和Pseudotsuga menziesii。P．coulteri和北美乔松也被诱导产生了子叶芽。Picea abies胚愈伤组织再生许多芽，发育成正常茎叶，有一株生了根。有意义的是从子叶表面能直接发育体细胞胚。
用胚和子叶培养体再生成功最有效的种有：P．radiata，P．taeda和P．monticola。松柏胚培养再生植株一般要求述之如下。
①芽诱导：射形松和犁头松培养的胚，只要细胞分裂素能诱导出90-100%多芽。生长素与细胞分裂素配合培养鳞果松出芽百分增高80-100%，西部白松83%，和长叶松，白松20-25%。ZEA和BA诱导鳞果松生芽效果比2ip和KIN为好。ZEA诱导的芽形成更健壮芽。
最常见从子叶直接形成不定芽。鳞果松和西部白松离体子叶培养比整胚培养生芽更有效。西部自松二者的生芽百分83-60。每胚芽数17．6-7．4，范围1-112至1-40。整胚产生优形芽，更分散而少错乱。也常见鳞果松离体下胚轴和茎尖直接产生芽，与子叶相比，频率较低，密度稀。挪威松胚愈伤组织再生大量不定芽。
②芽生长和伸长：芽长到5mm或更长时可供诱导生根。为了促进芽生长和伸长，必需将芽转移到无生长调节剂培养基上。Horgan等(1981)发现生根期间，芽长在适宜长度后，生长率下降和组织绿色化，对生存率有强烈影响。他们把活跃生长芽转入1／2总离子浓度、铁浓度加倍的芽伸长培养基，取得良好效果。这种条件性步骤，可能使芽建立它们的碳水化合物／氮平衡，有利生根。
③诱导生根：NAA是诱导松柏芽生根最有效生长调节剂，但加第二种生长素以促进较高生根百分。鳞果松单用NAA生根30%，加0．22μM BA增高到50%。西部白松加BA射形松加IBA与NAA配合为宜。射形松、鳞果松和西部白松生根百分各为86、50和30%。犁松和白松子叶芽未能生根。
④再生植株形成：由于诱导生根用的生长调节剂，抑制根生长，诱导后芽转入无生长调节剂条件以求根发育。活性炭可加入琼脂，以除去从生根培养基带来的生长调节剂。另-方面，可在湿雾条件下，在土中直接生根。这样根生存率比琼脂上生根的为好，鳞果松生长更旺盛。
3．其它种 从许多种培养的胚或再生愈伤组织曾发育成多芽和体细胞胚。这些材料对微繁殖有潜在应用价值，尤其是用常规园艺技术难繁殖的种和有消失危险的种如Zania pumila，以及从朱古力树体细胞胚生产种子脂质(朱古力)。
(1)多芽形成：早熟樱桃未成熟胚培养困难问题是初生根发育差，不可能移栽。Ivanicke等(1980)用加BA，GA，IBA和间苯三酚培养基诱导芽增殖，继之用NAA培养基培养离体芽生根，改进这些生活力弱植物产生再生植株。用含BA培养基从杏胚形成多芽取得成功。从切枝连续产生多芽也已成功。
日本柿胚愈伤组织培养在MS加NAA和KIN分化出根和芽。兰科许多种(例如Dactylorhiza mucalota)未成熟胚(种子)培养能产生大量原球茎，将由此发育成芽和根，转而植株。
(2)体细胞胚形成许多种胚培养诱导产生了体细胞胚，如寄生被子植物Cuscuta reflexa和Dendrophthoe falcata，蔬菜作物西胡芦和Sinapis alba，草本观赏植物窄叶芍药，树木Corylus avellana和观赏树木枸骨叶冬青和枸骨。除南瓜属和Sina pis用离体成熟胚外，上述种大都是从未成熟胚培养产生的。或从子叶(Dendrophthoe，冬青属和Theobxoma)或从下胚轴(南瓜属和Sinapis)和幼根(南瓜属)产生。常由带胚胚原愈伤组织产生居间愈伤组织。吸涨子叶表面也能直接产生胚。虽然生长素如2，4-D和其它生长促进试剂常用于诱导体细胞胚，尤以存在居间愈伤组织的为然(例如榛属，菟丝子属，Dendrophthoe，和Sinapis)，由于合子胚可能含有某些内生生长调节剂组合，有些情况下并非必要。Jelaska(1972)发现培养南瓜属下胚轴产生胚原愈伤组织，主要决定于这种组织的生理条件，与生长物质存在无关。Pence等(1980)报道可可属的体细胞胚，在无生长调节剂培养基中从子叶直接产生的，但是，当加生长素(IAA或2，4-D)和CW后，胚频率较高。冬青的胚形成不需生长调节剂。
枸骨叶冬青，英国冬青成熟果取心形期发育不全胚，培养在LS琼脂培养基不加生长调节剂和任意营养成分。从吸涨子叶亚表皮层，从1／3培养的胚(不同胚原发育时间的)，也从人工培养发芽的幼苗发育成苗。经四次继代后，子叶生产潜力未见下降。有些继代培养体产生三种不同类型的胚原愈伤组织。有些淡棕色胚状体产生花青素停止发育，那些无花青素的发育到成熟期。心形到成熟期，形态上与人工培育产生的合子胚相似。只有在胚状体切离母体组织和分别培养后，胚原根才伸长。从离体体细胞胚发芽产生的再生植株虽正常，有些在子叶上有淡色组织部分。英国冬青供试的7个克隆都有胚胎发生能力。
(三)克服种子休眠和种子不育性
许多种的种子休眠是由于化学抑制剂或结构内存在的机械抗性，而不是胚本身休眠。离体胚培养可能超越这些种的休眠。有些种产生不育种子，在适当条件下，不能发芽，终于在土中腐烂。种子不育性可能是由于胚发育不完全，突变的胚包被结构，结果发芽中的胚死亡，或产生难解的休眠类型，为此尚无解除这种休眠的方法。胚培养技术可能有从那些种子产生有生存力幼苗。
1．克服种子休眠 美洲级木种子生于坚硬不裂开的果皮中，常在深秋成熟。早知其难于发芽。Vanstone等(1982)培养未成熟胚，在种子成熟的任何阶段都可立刻发芽。Dunwell(1981)从复被结构取出胚，也可能放宽发芽温度。Randolph(1945)暗培有芒鸢尾离体胚28-30℃3-5天，然后移入弱光，2-3周后，取得幼苗有发育好的根，至少2或3叶。采用这种方法每年可得相继世代，用于培育新品种。
Nickell(1951)用胚培养垂山查子，离体胚接种培养基后24-48h就发芽。3-4周幼苗已成长到可供移栽入土。8个月后幼苗高3．5英尺，而用种子播种要9个月才开始发芽。Asen等(1951)蔷薇胚培养每年可产生二个世代。而用常规种子发芽程序，每世代要12-18月。Lammerts(1942)指出胚培养可用于果树大规模商品生产，大大地缩短落叶树的育种周期。杂种树可在杂交授粉后二年开花。杏和桃杂种胚培养比层积法发芽百分要高得很多。Hu(1975，1976)应用人工培养于美洲冬青发育不全胚，超越种子休眠阶段。离体胚在培养中经心形期→鱼雷期→线状成熟胚→发芽。成熟胚培养子叶加宽产生宽平胚。冬青胚人工培养下发育很快，I．opaca只要2周暗培就可使发育不全胚发芽。葡萄糖和非还原糖(即蔗糖、棉子糖、木苏糖)都能支持胚原生长，而冬青胚乳有抑制作用。可见冬青发育不全胚之所以处于静止状态，不是由于饥饿(不能利用其自身所含有的非还原糖)。提出胚乳中的抑制剂很可能是保持种子内胚休眠状态。
2．克服种子不育性 李属早熟品种不产种子。由于成熟果实内的胚，仍未成熟不能发芽。Tukey(1933)人工培养甜樱桃胚，使坚果树早熟品种有可能产生幼苗。Blake(1939)是用人工培养于果树育种首创者之一，培育成早熟桃栽培品种。
椰子胚培养主要困难促进根生长。Balaga等(1970)发现在转移到固培前，液培可促使胚产生最适芽和根生长。取得可移栽再生植株。
Rowe(1981)采用香蕉远缘杂交育种，以胚培养克服种子不育性问题(由于休眠)。结果取得难杂交的有50%发芽，而用正常方法只有10%。为了取得无病马铃薯种薯，改用种子繁殖代替营养(块茎)繁殖。远缘杂交杂种马铃薯种子难于发芽。培养43马铃薯种的31不同杂交组合种子的胚，Schilde(1982)取得发育良好杂种植株(与常规发芽程序相比)。有一例发芽46天时发芽百分从12．5%增高到培养6天时的88．6%。Henny(1980)培养Maronta leuconeura在加2iP基础培养基上取得100%发芽。
【参考文献】：
〔1〕Bhojwani，S．S．and M．K．Razdan 1983 Zygotic embryo culture．In： Plant Tissue Culture，Theory and Practice．pp．199-235，Elesevier，Amsterdam，Monnier，M．1978 Culture of zygotic embryos．In：Frontiers of plant Tissure Culture．(T．A．Thorpe ed．)pp．277-286，Univ．of Calgary Press，Calgary．
〔2〕Nostog，K．1979 Embryo Culture as a tool in the study of comparative and development morphology．In：Plant Cell and Tissue Culture．(W．R．Sharp，P．O．Larsen，E．F．Paddock and V．Roghavan eds．)pp．179-202，Ohio State Univ．Press，Columbus．
〔3〕Raghavan，V．1976 Experimental Embryogenesis in Vascular Plants．Academic Press，New York．
〔4〕Raghavan V．，1977 Applied aspects of embryo culture．In：Applied and Fundamental Aspects of Plant Cell，Tissue and Organ Culture(J．Reincrt and Y．P．S．Bajaj eds．)pp．375-397，Springer Verlag，Berlin．
〔5〕Raghavan，V．1980 Embryo culture In： Perspectives in Plant Cell and Tissu e Culture．International Review of Cytology Suppl．11B(I．K．Vasil ed．)pp．209-240 Academic Press，New York．
〔6〕Wardlaw，C．W．1965 Physiology of embryonic development in conmophytes．Encyclopedia of Plant Physiology，vol．15／1(W．Ruhland ed．)pp．844-965，Springer Verlag，Berlin．