染色体和核型变化
出处：按学科分类—生物科学 农业出版社《植物细胞培养手册》第178页（13927字）
(一)研究现状
许多年前，就知道感病的植物组织会出现不规则的有丝分裂，瘤细胞的染色休数日异常，甚至有的作者认为染色体数目异常引起肿瘤发生。然而，随着培养工作特别是组织培养工作的开展，越来越清楚地证明在许多正常细胞系中同样存在核异常，染色体不恒定，以及异倍体等现象。并已得到证实。植物组织和细胞培养中的愈伤组织的染色体更容易发生变异，初始培养时这种变异很小，随着培养的继续，在正常体细胞中也能观察到这种变异。
最近的有关用组织培养法来检测染色体组型和染色体行为的工作是由Straus(1954)完成的。他采用传粉后12天的玉米胚乳作材料，积累了许多不规则染色体发生和分布的证据。如多倍性，非整倍性，亚倍性，多线性，染色体桥以及滞留染色体等。Straus(1954)在培养正常三倍体胚乳(3n=30)中发现过具有105条染色体的。他认为其主要原因是培养基中加入了富含核酸的酵母提取物(0．5%W／V过滤灭菌)之故。因为，核酸盐在洋葱根尖的实验中亦发生同样效果。Straus提出是否完全是酵母浸提液的作用，他认为组织原来有的非正常条件(在玉米中出现过镶嵌型或杂色胚乳)，可能说明外观上的非正常现象。Straus还担心培养中这种染色体易变和不稳定性会使玉米胚乳培养再生植株归于失败。LaRue(1947)在大量培养材料中，发现形成根的比率低于千分之一，只有一株形成根轴芽和小叶。Straus(1954)推测“若能在传粉后12天之前的某些时候培养胚乳，则有可能避开这种假定因素的影响，从而有可能证实组织固有的全能性”。Straus还主张“其它以植物组织培养进行类似研究，应基于试图证明这种特性(染色体的不规则变化)是经组织培养而后天获得的”。
几年以后，Torrey(1959)报道：梨根在开始培养几天后，主要是二倍体细胞占优势，但到愈伤组织培养时，群体中则以四倍体细胞占优势。在这方面，Mitra和Steward(1961)主张采用那些染色体数目少，染色体外形易区别的材料进行培养。一种菊科植物(Haplopappus gracilis)是非常理想的材料。这种野生植物的正常二倍体由两条近中着丝点染色体和两条近端着丝点短染色体组成，短臂上带有随体。Mitra和Steward在Haplopappus培养中，发现二倍体占优势的细胞中存在着多倍体、非整倍体，以及分裂后期异变和形态发生变化的染色体。许多特征明显的无性系有各种染色体数目，高达64条，既有离开的，也有连合的。稍晚些时候，在同一实验室，Blakely(1963)描述了Haplopappus的一个品系保持近三年的二倍体优势。另外两个品系开始时为二倍体占优势，由于核型变异，使得染色体逐渐与正常的发生差异，在表现型(脆性，颜色等)上差异明显的细胞系，或品系的染色体组型发生异常。比正常细胞染色体数目多的品系中一般不含整倍体。在这些染色体组型发生变异的品系中，大多数细胞染色体外形明显可辨，但形态和数目均发生变化的染色体仍然存在。而且，由于分裂后期失调使得畸形染色体数目增多。Blakely(1963)发现有些Haplopappus品系能保持二倍体占优势而活力不减。这样，即使他在培养体中发现了许多染色体畸变现象，似乎也没有什么更适当的理由，说明为什么细胞在长期培养体中能保持正常染色体特性。
遗憾的是Haplopappus的培养细胞不能再生，因此，在染色体结构与再生能力之间不能得出相关。虽然如此，Haplopappus作为能忍受细胞学变异的培养材料还是理想的。并且，由于在它的游离细胞培养中出现单倍体。问题是对这种系统的减数分裂研究可能错过了机会。我们认为，根据早期对Haplopappus培养物的观察，发现在体细胞有丝分裂中存在类似于交叉的染色体排列现象。假定这就是有丝分裂中的交换或分离，且能预见和控制的话，那么这实际上早就为植物细胞培养的细胞遗传学分析开辟了新的途径。
二十年前证明胡萝卜细胞悬浮液培养物能形成植株。根据再生胡萝卜表型的准确表达，Steward等主张：无性系这个词严格来讲，就是再生。尽管在液体培养中增殖的胡萝卜细胞的某些群体中，核结构发生了某种变化，但悬浮培养再生植株没有细胞学上的差异。将这种具有正常基因型的细胞诱导出体细胞胚。经200株植株根尖研究，表明再生植株似乎都是正常二倍体。从而放弃了检查总数目为1000的根尖原有计划。虽然基因变异问题在胡萝卜试验中没有找到答案，但这似乎没有什么大问题，因为所有基因型的细微特征都可能准确表达，甚至白色花序中含花色苷的小花也不例外。一些年后，Mok等(1976)报道，他们从胡萝卜根愈伤组织中获得了正常二倍体植株。尽管规模较小，在他们的培养中还存在细胞染色体数目发生变化的例子，但毕竟还是获得了正常植株。
由于这些早期工作，因此能提出以下一些有意义问题：细胞培养中倍数性水平差异的依据是什么?细胞和组织培养中染色体是怎样发生变异的?发生变异的染色体在选择或继代培养中是否能够稳定?具显着变异的染色体在品系中还保持其显着性吗?多倍体中结构发生变化的染色体比二倍体中存在更广泛吗?组织和细胞培养中一定的基因型特征与一定的核型特征是否相互关联?能从不是整倍体占优势和核型发生变异的细胞培养成植株吗?能找出染色体重组对培养细胞或植物的基因型有明显影响的证据吗?鉴于某些基因型更适合培养和操作，它们对形态发生表达能力是否比其它的更强呢?仅从表面观察这些问题，因为在许多方面，答案才刚刚开始考虑。
有大量的评论概括了一段时期工作，鉴于它们都有其价值，许多研究者都希望有个详细的概括。
1．取样的问题 愈伤组织培养和液体悬浮培养所形成的培养物呈粘结团块，但易脆，容易呈碎片，取样方便。但是必须经常找出计算或检查选择细胞的方法是否会引入偏见。样品中实际上观察到的有丝分裂的细胞是否能代表整个培养物?即使是小心进行取样和多转移情况下，在结果上有很实际的差异问题。这些差异反映在所谓多种外形发育培养物的不同部分或甚至无性繁殖的细胞。不规则的多倍性和非整倍性可以局部发生，当然，这种情况反映染色体的复制和倍增，可在不同的细胞中以不同的速率进行。看来在愈伤组织块中能够并且已经发生混倍性毫无疑问。是什么选择力在作用和控制特殊细胞无性系的不同增殖没有多少证据，这是被迫接受一定类型的细胞可能被优先选择。故必须尽可能地在小心控制条件下的愈伤组织培养体不同部位取样，只有如此在继代培养保持期间，才能证实培养体是否已经发生改变。随机取少数染色体不足以建立一定的培养物状况。对甄别可能的镶嵌现象是必不可少的。如果一个品系或愈伤组织的质地是坚实的，紧密的生长习性，分生组织活动性常常限制于细胞梢的周围，或者培养物细胞的表层。Caplin(1947)多年前描述了这种愈伤组织的表面生长。在此情况下，愈伤组织是比较脆的，分生组织的活性可能被集中于分散团块的小结节中。
生长在琼脂或者相同培养基的不同部分进行重复培养，出现不同的染色体组型。尤其是如果它们能被限制于特定的部分，其变异的原因无疑必须进行深入探讨。当含有“正常”和“不正常”细胞的培养物作为继代培养的接种物时，由此得到的重复继代培养物(如果它们生长)，一定能反映出它的核型变异。进行下次继代培养时，一个含有全部不正常细胞的培养物，可能被选择作为继代培养接种物的来源。用这种方法获得的培养物，其正常或特有的核型可能完全丧失，尽管正常选择压力通常不利于甚至歧视非常核型。这个问题对于保持在琼脂培养基上的培养物，或是最大问题。事实上这就是为什么Steward和他的早期合作者决定，试图几乎单独使用液体培养工作的原因之一，尽管当时流行的看法与此相反。
通常取样的问题是次要的，不象细胞悬浮培养那样紧要。如果在继代培养用一个吸移管随机吸取细胞和细胞群，只要接种物是整个培养物的代表，继代培养过程本身应不利于改变一种培养物的特征。即使如此，这不排除突变和自然细胞选择的演变。目前常规地利用已知过滤器孔径的过滤技术，允许非常均匀一致的接种物通过，而得到的悬浮体可用于继代培养或进一步操作(图8-1)。
图8-1 从悬浮细胞制备于琼脂固体培养的细胞和细胞团的操作程序图解
2．体细胞多倍性和多体性 具有不同染色体数组成的相同个体的条件下，不是象可能推测的异常一样。除二倍细胞与2n数目的染色体外，某些植物含有很多4n，8n甚至16n染色体的多倍体细胞。这个现象叫做体细胞多倍性。导致体细胞多倍性的过程叫做内源多倍体化，这是由于染色体在核内不断增殖，而有丝分裂在每个多倍性新的水平上发生干扰。然而，有关多倍体发生的组织范围几乎没有充分的资料。这种事实是清楚的，就是发生于营养繁殖的较为普遍和特别普遍的那些植物。从发展观点看，如果在另一些二倍体个体中出现了整倍体、非整倍体和多倍体细胞的话，那么仍需进行精确的检测。但是，体细胞变异很显然是由于基因型不同的个体所致。以营养繁殖的Locasia，特别令人满意地证实了这个现象。D＇Amato(1952)，Geitler(1953)和Chiarugi(1954)回顾了多倍体发生和来源方式，D＇Amato特别注意本是二倍体植株的核内多倍性与分化间关系。
D＇Amato早在1964年写出了他希望能成功地建立单个植物细胞的分离和培养技术，这是植物细胞的细胞学和植物遗传学研究的新阶段。然而，高等植物细胞的无性系不容易从早期烟草上成功的经验扩大应用到其他植物。在这种情况下，有可能利用较高倍数性和非整倍体的单细胞产生的无性系组织。这就表明在启始外植体已存在的多倍体核决不是染色体变异性的唯一原因。核内有丝分裂有可能发生，以及持久地染色体桥也可能在多倍体细胞内产生。
多数研究者当不需要多倍体时，常为产生多倍体而苦恼，如石刁柏产生四倍体和胡萝卜产生四倍体。另一方面，它偶而也为给定作物的潜在改良提供良好机会。马铃薯组织培养物可用于产生四倍体。组织培养对蔗糖工业的研究已作出了真正贡献。通过常规方法不可能实现染色体加倍，但是愈伤组织的技术却能实现之。这也为核查染色体数对产量潜力的影响，而发展一套前所未有的非整倍体系列开辟途径。
3．非整倍体性 植物细胞和愈伤组织培养物中，出现非整倍体细胞，已有大量文献报道。少数报道了用培养技术使非整倍体植株再生。烟草的非整倍体很好地从正常和肿瘤组织中获得植株提供了证据。其他一些植物组织培养获得非整倍体植株也有叙述(无毒蔓陀罗)。镶嵌现象更是常见。
Krikonian等，已从悬浮培养物中分离出几种初级的三体黄花菜植株。初级三体为检验独立的连锁群和把连锁群归属于特定染色体提供了极好的细胞遗传手段。因为初级三体中有三个同源染色体而不是二个，因此对于那些定位在这条染色体上的基因，子代分离中的遗传比例，在一个隐性基因的正常二体杂合体的F2和回交世代中获得的3∶1或1∶1的比例是很不相同的。初级三体也能把未定位的基因归属于各连锁群。陈在遗传意义上的作用之外，所获得的各种初级，次级和三级三体能够用于研究复制整体染色体，一个染色体臂或部分染色体臂对有机体生态学，解剖学和生理学的效应。通过三体生物能够阐明一个物种基因组的基本特性。有充分理由相信，能从细胞无性系中获得染色体异常植物。
4．易位 细胞培养物中较常出现具有重排染色体的细胞无性系。但是它们之间通常是相替的，因为在大多数研究中，染色体数没有改变的迹象。在培养物中，细胞生长期间和繁殖过程中，有丝分裂极端的无规律。看来大多数的有丝分裂失调使得这些细胞与这个群体中的其它细胞竞争能力降低。它们不能在继代培养中保持。具有形态发生能力的百合细胞系，因染色体重排而保持培养物稳定性。这些培养物保留它们正常的倍数性，而且外观上形成正常植株。但Shericlan(1975)没有察觉这些培养物再生植株的表现型上明显差别。在黄花菜悬浮培养物中发现了易位。尽管确信在某些品系中保持这种状态，但还不能明确地说明在再生植株中没有表现型差异的结论。很清楚它对形态建成能力无有害作用。
很久以前对培养细胞群体中能够发生易位就有所认识，但这些培养物多数能够进行细胞学分析而不能植株再生。Bayliss(1975)常在胡萝卜细胞中遇到频繁地染色体重排，Novak(1974，1981)曾描述了蒜的长期培养愈伤组织的染色体重排。毫无疑问，发生了许多易位但未被察觉，培养条件对选择能够起着重要作用。
5．方法的进展 事实上本节所述经典方法，目前仍有可能满足许多研究者足够的需要。用显微分光光度计测定分生组织的每个核的DNA，有时有助于确定二倍体和多倍体细胞的比例。但是要知道染色体数和结构的微小变动，用这些方法是不能测出。它充其量不过是一种粗糙的测量。
应该经常地注意新的预处理化学药品，不管它们初看起来是如何的不可能，以及能够帮助确立众所周知难弄的植物组织核型的其它方法(玉米胚乳)。荧光染色法在小染色体，或在常规技术条件下存在许多问题的研究变得越来越有用。
在许多情况下，银染色技术能够清晰地看见核仁区域(NORs)，在某些情况银染色技术能够同时使NORs和着丝点染色。然而，这些都是相当专门的技术。
(二)核型分析技术
介绍之前，有必要再一次强调不同的研究者总是用他们偏爱的方法取得同样的结果，且不同的材料，由于它们的种类或它们在培养中的特殊阶段或发育程度，常常要求完全不同的程序。大量文献叙述适合于完整植株或植株某部分方法，但是很少提供详细而适合于非细胞结构的，或愈伤组织培养物或悬浮细胞的指导方法。
1．样本材料的选择 当用任何一种方法培养，能在试管中重新长出植株的时候，一般来说，这项工作就会直线向前。细胞分裂中期的根尖细胞是理想的。即使这样，通常直接用琼脂培养基甚至液体培养的材料制作根尖压片有相当困难。把已长根的小植物，从无菌培养转移到
石-珍珠石或
石的环境里，其效果一般就好。在这些条件下，形成的新根更经得起研究的检验，因为它们将会分化成许多细胞。往往同决定通过给定培养技术产生的植株是否存在镶嵌现象有关。检查根部以外的其他部分也常常是有用的，嫩叶常常是有丝分裂的良好来源。象烟草，幼小花冠组织也能利用。象棕榈树难以获得小孢子母细胞或根的植物，花粉培养为染色体研究提供了可选择的途径。应该知道仅仅进行根尖分析，肯定不能为染色体组成提供可靠证据。扇形和周缘嵌合体并不罕见。在这种情况下，减数分裂分析特别重要。
2．选择适当的方案 研究者们有可采用的各种化学药品和方法，为了要弄清到底使用和遵循哪个方案进行工作最好，还要查明、研究和完善下列复杂多变的条件：①最好的细胞抑制剂或预固定化学药品。②最适浓度。③处理时间长短。④处理试验材料所用的细胞抑制剂用量。⑤使用细胞抑制剂时的最好环境条件，如：光照／黑暗，高温或低温，渗透的环境，等等。
制定适于核型分析的细胞分裂中期染色体的重要步骤梗概如下：
①预固定。
②固定。
③水解和浸渍。
④染色。
⑤压片。
虽已成功地使用了好几种抑制剂，但是在试验前，还没有办法知道这种抑制剂是否比另一种的好。Sharma和Bhattacharya(1960)用大量的预处理化学药品，在几组植物上进行比较研究。秋水仙碱，溴萘，长春花碱，8-羟基喹啉，对二氯苯，香豆素，七叶灵，等等。用完整的根试验，发现溴萘相当令人满意，尽管预固定的准备有些不方便。溴萘也用于研究愈伤组织培养物，但是预固定处理需要更长时间，通常为5．5-8h。在低温环境(大约4℃)下处理同样有利。但是在收集和阐明论据上必须谨慎，因为过长时间处理有导致多倍性的危险。一般来说，愈伤组织细胞另一个特征是它们比有组织的分生组织细胞染色淡得多。同样，因为一些愈伤组织培养物相当坚硬又不易脆，在水解前涂压细胞可能有所助益。把愈伤组织小心地切成几部分，分装于不同试管中，贴上标签，然后涂压，加工处理，对愈伤组织染色体制图是有益的。一般来说，愈伤组织的最外部分，具有最多分裂相。在较老的继代培养中，最内层的细胞可能坏死和无有丝分裂相。一般要在愈伤组织培养物中找到好的有丝分裂相相当困难。
细胞悬浮培养物对染色体研究最合适。同时必须确定处理采集的最适当时间。决不能以一个偶然的事实来确定细胞处在最高分裂的时期。
在悬浮培养物中，已经使用过溴萘、秋水仙素、长春花碱和CIPC作为抑制剂。即使这样，仍建议在作任何结论以前须试验多种抑制剂。例如，在液体悬浮培养物中，使用溴萘的主要弊端，就是洗掉这种“油性”的预固定化学药品，既困难又麻烦，否则使用它是相当成功的。必须再一次强调，由于所使用的培养系统、分类群、样本材料的年龄等不同，它们对化学药品的敏感性就不同。
秋水仙碱作为一种抑制剂已经使用多年，一般用0．01%-0．5%(w／v)的水溶液。在临用前配制秋水仙溶液，可是，有的研究者却坚持，秋水仙碱液能够在一个不透光的容器中，于冰箱里贮藏一年左右而不失效。在黄花菜细胞悬浮培养物中，使用0．5%(w／v)秋水仙碱液可产生良好效果。乙酰甲基秋水仙碱(Colcemicle)通常比秋水仙碱更灵敏，估计只要用秋水仙碱浓度的三分之一。可是乙酰甲基秋水仙碱非常昂贵，不能推荐作为常规使用。秋水仙碱和乙酰甲基秋水仙碱都是高毒化学药品，应该采用适当的防护措施。
从事动物细胞工作的研究者，已广泛地用长春花碱硫酸盐使细胞停止在分裂中期。脱羰秋水仙碱用于植物细胞的浓度相当于10-40μg／ml，较高浓度一般产生过短缩的染色体。在黄花菜悬浮物中，以20μg／ml最理想。需在临用前配制水溶液，因为这是与冷藏要求(0-5℃)一致的。然而，也有人认为在室温中存放几天仍是稳定的。除草剂异丙基-N-苯基氨基甲酸脂(IPC)和它的间氯苯基衍生物，N-3-氯苯基氨基甲酸酯(CIPC)都是有丝分裂的抑制剂，并且已用于缩短染色体。Storey和Mann(1967)首先，便注意到这种化合物的应用。
已知〔戊二酰〕亚胺环己酮能够影响染色体的缩短，但是把它与预处理化学药剂结合使用还是近来的事。Tlaskal(1980)发现甘蔗用8-羟基喹啉和〔戊二酰〕亚胺环己酮(分别为250mg／l和70mg／l)进行预固定是有效的。这个方法似乎对那些具有许多小染色体植物特别有用，因为它能引起大幅度的缩短，能够容易地得到可靠统计数据。就我们所知，〔戊二酰〕亚胺环己酮单独使用时非常有效，但是它会使小染色体过分缩短，实际上对确定核型无用。降低〔戊二酰〕亚胺环己酮浓度，也似乎没有导致减少缩短程度的倾向。
Sharma(1956)对组织固定作用进行了深入的评论，Sharma(1980)汇综了固定剂资料和使用方法。许多研究者长期成功地使用着Farmer固定剂。它是由3∶1(v／v)的无水酒精和冰醋酸混合成的。有人发现用3∶1的乙醇(95%)和丙酸的混合液有助于小染色体的染色。固定剂应该是临时配的。如果在水解和染色以前，标本需放置任何一段时间，都必须重新放在固定剂中，并换两次70%的酒精，然后在4℃下贮藏。然而，在大多数情况下最好是很快处理样本。
随后的处理或多或少是常规手续，一直在不断地取得进步，并且具有相当小的染色体的植物也开始能有效地确定出核型。
(1)用1-溴萘预固定操作
①量取100ml全玻璃器蒸镏过的蒸镏水，放入250ml具磨口玻璃塞的三角瓶内。
②小心加入50mg皂角苷，不要让它粘在玻璃瓶内壁上。慢慢溶解，约需5min，不能摇荡。待溶解后，轻轻地旋动三角瓶，由此出现少许泡沫。
③加入64mg MES〔2-(N-吗啉)乙基磺酸〕。
④加入30ml1-溴萘。
⑤摇动三角瓶，使水溶液饱和。
⑥如果上述操作适当，分散相仅分离出几毫米的1-溴萘于容器底部。
⑦使用前始终要保持混合物呈很好的分散体系，因此须临用前配制成新溶液。
(2)根尖细胞分裂中期分析的操作程序 在无菌培养条件下，可以直接诱导出根，或者将繁殖体放在
石上，定期地用稀的肥料溶液(如MS培养液的无机盐)湿润蛭石置于温室或生长室里，也能形成根，无离子水似乎适宜于短期培养，但通常在几天至两个星期间可产生适合检查大小的足够数量根。然而在这方面的精心设计并无多大帮助，常需由经验决定。
(3)分裂中期染色体压片样本制作程序
①采集根，洗去蛭石用剪刀剪取根尖部分，或最好采用完整植株或者再生植株。后者常有大量分裂相，特别是置于阳光和适合植株生长的温度下，更是如此：可以断定，这是因为完整植株上细胞分裂进程比取自枝条根系的更易发生。
②在10℃和光照下，1-溴萘溶液的预固定时间约4．5-5．5h。混合物包括30ml1-溴萘，50mg皂角苷，64mgMES、100ml水(见前述操作程序)。预固定时间不得超过6h，否则可能发生多倍体化。
③将根从上述溶液中取出，在室温下，用无离子水漂洗3-4次后，立即甩掉和吸干其过量的水。
④在预先冷至4℃的无水酒精-冰醋酸(2∶1分别为100ml和50ml，或3：1)中漂洗两次。应该指出：冰醋酸是具有腐蚀性的，处理时要特别小心。同时也应注意，漂洗前，必须将无水乙醇-冰醋酸固定液预冷至4℃。
⑤用剃刀片或外科手术小刀，横切取植物的根(根尖端3-4cm或者适宜的长度)，立即而缓慢地插入4℃的固定液中，其材料可保存于固定液中2个星期不会变质，但是就形态学上而言，通常在96h内发生变化。如果一定要延长贮藏时间，就必须把材料重新放入70%的酒精(换两次较为适当)，并在4℃下贮藏。
⑥把根尖放入1N HCl溶液中(82．2ml的浓盐酸和917．8ml的水)在58-60℃下，水解5-20min，倒出上层清液。水解的时间很重要，并随植物种类不同而不同。一般情况下，水解的时间8-10min就足够了。
⑦用改良福尔根染色剂，根染色时间为5min到24h，然后在室温下，自来水中浸泡5min左右。注意：显色时间的长短很重要，一般情况染色1h左右(见下面的步骤)。
⑧材料放在厚滤纸或擦手纸中，用一个适当的物体(如铅笔橡皮头或钝的解剖针)轻压，使醋酸洋红被吸压干。注意：适当制备的根只要轻压就会分离，根细胞将会遍布载玻片。
⑨在这种情况下，这些染色材料是暂时的，在几小时内就会变干，须用等量的石蜡和树胶的熔融混合物，密封盖玻片的四周，这种载玻片将可以保存几天。
⑩(供选择)可根据以下方案制作永久切片。(a)如有必要，小心地把盖玻片四周的石蜡和树胶的混合物刮去，要注意不要移动盖玻片。(b)然后于载玻片下吹放CO2，使残留在盖玻片下的溶液迅速凝结。(c)等切片完全结霜，用一把剃刀小心地掀起盖玻片的一角。通常盖玻片会立刻爆开，载玻片和盖玻片都粘附细胞〔可选择地用二氟甲烷(CCl2F2)爆开盖玻片〕。(d)快速而小心地把载玻片和盖玻片都放入盛有95%酒精的广口瓶中，约5-10min。(e)100%无水酒精，5-10min。(f)固定于一滴permount或其它适当固定介质中。
附染色体染色步骤：
A．改良福尔根法
①煮沸800ml蒸馏水，加入6g碱性品红，用玻璃棒搅拌，然后放置冷却到50℃(用温度计测量)。
②用双层事先被水湿润的Watman1号滤纸进行过滤，然后加入12g K2S2O5，搅拌，使K2S2O2溶解。
③加入32ml冰醋酸，然后倒入具有瓶塞的棕色容器中，贮藏于冰箱中，至少要过一夜才能使用。注意：最后的颜色为浅红色，这种溶液应贮藏在低温阴暗处。即使这样保存，也只有两个月的有效期。
B．福尔根法
①加1g碱性品红和1．0g K2S2O2(或Na2S2O2)于100ml盐酸(0．15N)溶液中，然后静置24h。
②每100ml混合液加一满匙(约500mg)活性碳。
③先用几滴1N HCl湿润Watman1号滤纸，然后用布氏漏斗过滤。滤液应该确实无色。
④用一个棕色或其它暗色的具塞玻璃容器，贮藏上述滤液于冰箱中。福尔根染色剂的配制会有许多变化，碱性品红的多样性是主要的问题。上述溶液只有2-4个月的有效期，如果溶液变成粉红色，就应该丢弃。
C．醋酸洋红
①混合0．5g洋红和45ml冰醋酸，加入55ml蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，水浴加热混合物至沸腾，继续加热2min，至洋红溶解(溶液会迅速变色)。
②用双层Watman1号滤纸趁热过滤。
③加一些醋酸铁或其它醋酸盐(过量)。
④再用双层Watman1号滤纸过滤。滤液装入棕色或其它暗色瓶中冷冻。这种溶液非常稳定，能使用很长时间。一些研究者喜欢用高浓度溶液。然而，多数情况下，以含有45%醋酸的1∶1稀溶液为好，因为稀溶液可以确使细胞不着色。
(4)悬浮培养细胞的有丝分裂分析的程序
①在使用前一天，准备新鲜的细胞生长抑制剂溶液。
②用宽嘴吸移管无菌吸取细胞悬浮物样品(每次约20ml)，然后分别放入35ml的锥形离心管(离心管有金属罩子)。
③把试管静置在试管架上约5min，让细胞沉降。
④倒掉上层清液，留下少量液体，不使细胞暴露于空气中干燥而受影响。
⑤每个试管中加约10ml“冲洗溶液”，小心洗涤细胞。
⑥重复4、5步骤2-3次，以达到充分洗净的目的。
⑦选择可以让细胞暴露在宽敞的表面上的瓶，如欧氏三角瓶，不要用离心管或试管。
⑧用一支已消毒的吸移管把细胞从锥形离心管中转移到三角瓶中，用某些细胞生长抑制剂溶液以取得转移效果。这对于保留某些尚未与细胞抑制剂接触的细胞以供研究，是非常有用的。在把细胞抑制剂加入“试验”样品同时，用固定剂处理。加入新配制和预先冷却的固定剂，细胞至少要于4℃下保持2h，没有充分研究“对照”，就不应对实验作出解释。
⑨加以足量的细胞生长抑制剂以覆盖细胞(细胞生长抑制剂的数量应大致等于处理最初转移的悬浮体的体积。即，起初是20ml培养基的细胞悬浮液时，那么加入20ml细胞生长抑制剂，就足以覆盖洗涤过的细胞)。
⑩把样品放在旋转振荡器上，振荡至必需时间。振荡速度必须非常慢(25转／min)。这一步操作最好在一个冷室(5-10℃)内进行。一般需时3．5h，但可在半小时至4．5h范围内变动。
⑾把瓶中的样品转移到干净的离心管内。
⑿将离心管放在无干扰的试管架上静置5min左右，让细胞沉降。
⒀倒出上层清液，弃除；把细胞洗涤几次，倒去全部洗液。
⒁用消毒过的吸移管，缓慢地沿离心管壁滴下，预先冷却(4℃)的固定剂，注意不把细胞搅起。尽管如此，仍需使它们从“片状沉降物”释放出来，以达到均匀固定。
⒂将离心管冷冻10min。
⒃用吸移管小心地吸取固定剂(用洗耳球!)重复第14步骤，然后把离心管放入冰箱中约1．5h。
⒄用吸移管小心地将固定剂移去。
⒅最后一次固定常常把样品分成若干等分，装入10个容器中(5个左右)，这样较为适合而有益的。
⒆把样品存放在冰箱中，最少12h。如果长达48h，则制成的样本质量差。
⒇用水解法制作样品时，把每个样品中固定液的上层清液倒出。每个样品倒在滤纸或毛巾上，以吸去过多的液体。
(21)向每个样品加几毫升1N HCl，放在58-60℃培养箱中12-15min(水解时间的长短随样品而异，培养的细胞比完整器官的时间要长些)。
(22)轻轻倒出水解液，加入福尔根着色剂(见前面操作)。
(23)一小时后，取出细胞，在一滴45%醋酸中压片。
【参考文献】：
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